邱玲玲 陳雯 支星 肖瑩

九江職業(yè)大學護理學院，江西 332000

肝纖維化是肝臟遭到各種致病原侵襲，引起肝臟損害與炎性反應(yīng)后，導致肝臟結(jié)構(gòu)和肝功能異常改變的病理過程。在慢性肝病-肝纖維化-肝硬化的病情演變過程中，肝纖維化是關(guān)鍵的中間環(huán)節(jié)。如何有效地阻斷肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，積極治療和逆轉(zhuǎn)肝纖維化，受到國內(nèi)外學者的高度重視，對防治肝硬化肝癌具有重要意義［1-3］。復(fù)方鱉甲軟肝片（Fufang Biejia Ruangan tablet，F(xiàn)FBJ）是原中國人民解放軍302醫(yī)院在30多年臨床治療經(jīng)驗的基礎(chǔ)上研制而成的，它是國內(nèi)第一個以治療肝纖維化和早期肝硬化為主的國家級中藥新藥，是《肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南》［4］推薦的用于抗纖維化及早期肝硬化的藥物?，F(xiàn)已廣泛用于肝纖維化及多種臟器纖維化疾病的治療。該復(fù)方由鱉甲、莪術(shù)、三七、黃芪、赤芍、冬蟲夏草等11味中藥精制而成，組方復(fù)雜、成分繁多，但目前對FFBJ抗肝纖維化作用物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制尚未完全闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是基于計算機虛擬計算、高通量組學數(shù)據(jù)分析，利用生物信息學方法，研究多成分-多靶點-多疾病的機制，在方法學上具有整體性、系統(tǒng)性的特點，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方及單味藥的研究［5］。隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學的完善與發(fā)展，中醫(yī)藥發(fā)揮臨床療效的分子及機制研究也逐漸變得可視化、效率化和標準化，其理論的建立為多靶點藥物的研究提供科學理論支持，也為研發(fā)新藥提供理論源泉［6］。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法和技術(shù)，從系統(tǒng)生物整體的角度探討FFBJ的抗肝纖維化的作用機理，構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，為深入探討FFBJ抗肝纖維化的作用機制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 活性成分的篩選口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）是藥物篩選、評價化合物成藥性的重要的動力學參數(shù)。因此，通過中藥系統(tǒng)藥理學技術(shù)平臺（TCMSP）和文獻檢索收集復(fù)方鱉甲軟肝片11味藥的所有化合物，并根據(jù)其ADME性質(zhì)進行篩選，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為篩選標準，篩選出活性成分。

1.2 潛在作用靶點的預(yù)測反向藥效團匹配方法（PharmMapper）是通過對Targetbank、Drugbank、Binding DB和PDTD 4大數(shù)據(jù)庫進行快速檢索而獲得藥物靶點信息。該服務(wù)器內(nèi)含7 000多個藥效團模型，涵蓋110種臨床適應(yīng)證，具有運算速度快、靶點信息全面等優(yōu)點。本研究挖掘TCMSP數(shù)據(jù)庫中FFBJ活性成分的潛在靶點，并登陸PharmMapper服務(wù)器 （http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），上傳FFBJ的活性成分sdf格式文件，采用“反向藥效團匹配方法”得到虛擬篩選結(jié)果，將兩部分數(shù)據(jù)進行整合。同時使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（UniProt）中UniProtKB搜索功能（https：//www.uniprot.org/），通過輸入靶點名稱并限定物種為人，將檢索得到的靶點校正為其官方名稱，經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫檢索和轉(zhuǎn)化，獲取與活性成分相關(guān)的靶點信息。

1.3 肝纖維化疾病相關(guān)靶點獲取登錄Drugbank數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org），以“Hepatic fibrosis”為關(guān)鍵詞檢索與肝纖維化相關(guān)的靶點基因，作為肝纖維化的靶基因。

1.4 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將獲得的FFBJ活性成分相關(guān)靶點與肝纖維化靶點基因相映射，使用Venn作圖分析，獲得二者交集靶點基因，然后使用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，并根據(jù)化合物與靶點連接情況進行拓撲分析，預(yù)測FFBJ抗肝纖維化的關(guān)鍵活性成分和關(guān)鍵靶點。

1.5 關(guān)鍵靶點的基因本體（GO）和基因組百科全書（KEGG）富集分析 GO分析主要用于注釋基因的功能，包括細胞功能、分子功能和生物功能，已被廣泛應(yīng)用于生物基因功能分類［12］。使用clusterprofiler對FFBJ治療肝纖維化的靶基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，以研究其主要生物學過程和代謝通路，以統(tǒng)計學超幾何分布定量（P值）篩選P＜0.05的生物過程及信號通路，用半編程性質(zhì)的腳本軟件Rproject繪圖將其可視化。

2 結(jié) 果

2.1 FFBJ活性成分的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出FFBJ中的活性成分，得到符合條件的成分43個。另外，Ginsenoside Rb1、Ginsenoside Rg1、Notoginsenoside R1、Ginsenoside Re、Adenosine雖然其OB值相對較低，但有文獻報道這5種化合物為FFBJ中的活性成分且含量較高［5］，因此共篩選出48個活性成分，見表1。

表1 FFBJ的主要活性成分

2.2 FFBJ中主要活性成分的潛在作用靶點信息 將PharmMapper返回的各個活性成分的潛在作用靶點根據(jù)匹配度fit score由高到低進行排序，每個成分取前30個靶點。并與TCMSP數(shù)據(jù)庫中整理出所有活性成分的潛在靶點進行對比分析，再將所獲得的活性成分預(yù)測靶點導入Uniprot數(shù)據(jù)庫進行基因標準化，去除重復(fù)值，歸納總結(jié)篩選出931個潛在靶點。

2.3 肝纖維化疾病相關(guān)靶點獲取 使用Drugbank、OMIM數(shù)據(jù)庫收集到肝纖維化潛在靶點，合并去重復(fù)后共得到1 117個肝纖維化的相關(guān)靶點。

2.4 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將931個FFBJ化合物作用靶點與1 117個肝纖維化靶點基因進行Venn分析，獲得藥物-疾病交集基因70個，從而得到FFBJ治療肝纖維化的相關(guān)作用靶標，將其定義為“關(guān)鍵靶點”，對應(yīng)FFBJ的44個活性成分（Frutinone A、Peroxyergosterol、Ginsenoside Rg1、Perlolyrine 4個成分未找到交集靶點參與相互作用）。

將FFBJ的活性成分、關(guān)鍵靶點導入Cytoscape軟件，構(gòu)建“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。在網(wǎng)絡(luò)圖中，綠色六邊形代表活性成分所作用的靶點，紫色長方形代表FFBJ所含有的活性成分。分析網(wǎng)絡(luò)圖，可知網(wǎng)絡(luò)圖中共包含節(jié)點（node）114個，節(jié)點與節(jié)點之間的作用關(guān)系，即邊（edge）384條，展示了FFBJ治療肝纖維化多成分、多靶點的作用。借助Cytoscape對活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，得到自由度、介數(shù)、中心度均大于平均值的成分的交集，篩選出可能是FFBJ治療肝纖維化的關(guān)鍵活性成分18 個 ，即 Calycosin、Formononetin、Ginsenoside Re、alexandrin_qt、ginsenoside Rg5_qt、bisdemethoxycurcumin、Mandenol、DFV、Spinasterol、CLR、adhyperforin、7-Methoxy-2-methyl isoflavone、Mairin、ZINC03860434、quindoline、24-Ethylcholest-4-en-3-one、hyperforin、poriferast-5-en-3beta-ol。同法篩選出可能是FFBJ治療肝纖維化的關(guān)鍵靶點20個，即ADK、RXRA、CASP3、MMP2、CYP2C9、MAP2K1、NR3C1、FECH、NR1H4、VDR、RBP4、GC、TGFB2、NR1I2、PPARA、GRB2、IL2、SHBG、SULT2A1、NR3C2。

圖1 FFBJ活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 FFBJ治療肝纖維化作用靶點的GO功能分析與KEGG富集分析 70個藥物活性成分-疾病交集基因影響了92個生物學過程（P＜0.05），選取排名前20的功能信息繪制柱狀圖，如圖2。結(jié)果顯示，F(xiàn)FBJ所涉及的生物信息學功能與過程包括類固醇激素受體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、激素受體粘合物、肽內(nèi)切酶活性、細胞因子受體粘合物、類固醇粘合物、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、細胞核激素受體粘合物、羧酸粘合物、有機酸粘合物、轉(zhuǎn)錄共激活劑活性、絲氨酸、蘇氨酸激酶活性等生物過程。

圖2 GO功能富集分析柱狀圖

KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)FFBJ治療肝纖維化70個關(guān)鍵靶點顯著富集（P＜0.05）在128條通路上，其中包括PI3K-Akt、癌癥蛋白聚糖、絲氨酸蛋白激酶（MAPK）、乙型肝炎、前列腺癌、IL-17、內(nèi)分泌抵抗、松弛激素、FoxO、腎素、弓形蟲病通路、卡波西肉瘤聯(lián)合皰疹病毒感染、TGF-β1、PPAR與Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK/STAR）等多條信號通路。圖3展示了前20位KEGG通路富集分析結(jié)果，其中參與PI3K-Akt信號通路的關(guān)鍵靶點數(shù)量最多，共18個，包括MAP2K1、FGFR1、GRB2、JAK2、IL2、MAPK1、PIK3CG、IGF1等，且靶點MAP2K1、MAPK1、MAPK8、GRB2、MAPK14在前20的信號通路里涉及10個以上的信號通路；靶點CASP3、TGFB2、MDM2、SRC、IGF1、MMP9、MAP2K1、FGFR1、JAK2、HSP90AA1、GSK3B、SRC、MMP2、MET、CDK在前20的信號通路里涉及5個以上的信號通路。

圖3 FFBJ治療肝纖維化關(guān)鍵靶點參與的通路富集信息氣泡圖

3 討 論

復(fù)方鱉甲軟肝片由鱉甲、赤芍、冬蟲夏草、三七、紫河車、黃芪、當歸、連翹、莪術(shù)、黨參、板藍根11味中藥組成，是首個用于肝纖維化治療的中藥制劑，其臨床療效顯著。因

此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，借助數(shù)據(jù)庫和軟件對FFBJ抗肝纖維化的作用機制進行探討具有重要意義。

采用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)并進行拓撲分析，共預(yù)測到FFBJ治療肝纖維化的18個活性成分和20個關(guān)鍵靶點。通過Rproject對靶點基因進行GO富集分析和KEGG代謝通路分析，得到GO中92個生物過程條目和128條KEGG通路。圖1表明，F(xiàn)FBJ抗肝纖維化的活性成分和靶基因之間是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，交互作用顯著，可見FFBJ治療肝纖維化具有多成分、多靶點的特點。李艷等［7］表明黃芪的主要成分為黃酮類，可通過抗脂質(zhì)過氧化，減少肝細胞變性、壞死，產(chǎn)生抗肝纖維化作用。本研究得到的活性成分中的毛蕊異黃酮、芒柄花素度值較高（依次為10、18），均屬于黃芪黃酮類成分，這就從理論上印證上述研究結(jié)果。Yuan等［8］發(fā)現(xiàn)人參皂苷、三七皂苷可通過Notch、TGF-β1/Smad3等信號通路顯著抑制肝成纖維細胞發(fā)揮抗肝纖維化作用，而本研究也預(yù)測出了抗肝纖維化的皂苷類成分如人參皂苷Re、人參皂苷Rg5。此外筆者還發(fā)現(xiàn)FFBJ中未見報道的Mandenol、bisdemethoxycurcumin、adhyperforin、Mairin、Spinasterol、7-Methoxy-2-methyl isoflavone、CLR、ZINC03860434、quindoline、hyperforin 24-Ethylcholest-4-en-3-one度值較大（大于9），連接靶點多、類藥性也較高，提示這些化合物也可能是FFBJ潛在的抗肝纖維化活性成分，有必要進行后續(xù)試驗驗證。

Venn分析得到FFBJ作用靶點與肝纖維化靶點的交集基因共70個，經(jīng)拓撲分析得到20個關(guān)鍵靶點，其中MAP2K1、NR3C1、FECH、RXRA、RBP4、TGFB2、PPARA（大于8）等靶基因度值較大，可能是FFBJ治療肝纖維化的重要靶點。進一步提煉FFBJ治療肝纖維化的生物學過程，發(fā)現(xiàn)其涉及類固醇激素受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、細胞因子受體黏合物、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等生物過程，這與肝纖維化疾病的發(fā)展有一定關(guān)聯(lián)性。另外，通過對70個交集基因進行KEGG信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)128條信號通路與肝纖維化的發(fā)病顯著相關(guān)（均P＜0.05），包括PI3K-Akt、癌癥蛋白多糖、MAPK、乙型肝炎、IL-17、TGF-β1、PPAR、JAK/STAT等信號通路。而拓撲分析得到的關(guān)鍵靶點在上述信號通路中多次富集，如靶點RXRA、CASP3、MMP2、MAP2K1、TGFB2、GRB2、IL2。肝纖維化主要病理特征為細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）分泌增加以及降解減少，引起ECM大量沉積，而肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）是分泌ECM的主要效應(yīng)細胞，在肝纖維化過程中起著關(guān)鍵作用。肝纖維化是多種細胞因子和多條信號通路共同參與、交互作用的復(fù)雜過程，從而實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)肝纖維化的可能。盧瑋等［9］綜述肝纖維化相關(guān)重要的 主要信號通路，如MAPK、PI3K/Akt、IL-17、TGF-β1、PPAR、JAK/TAT等信號通路。這與本研究中FFBJ肝維化靶點的KEGG代謝通路富集結(jié)果幾乎一致，表明FFBJ具有多靶點、多通路抗肝纖維化的潛能。

TGF-β1/Smads信號通路是TGF-β1促纖維化作用中最經(jīng)典的途徑，通過作用于HSC表面的TGF-β1受體進而引發(fā)促纖維化效應(yīng)，在HSC的活化與增殖、ECM的沉積和肝纖維化的發(fā)展過程中具有重要意義。本研究中GO富集分析的生物學過程也涉及TGF-β1轉(zhuǎn)錄因子活性和關(guān)鍵靶點TGFB2。研究表明FFBJ藥物血清能顯著抑制HSC分泌TGF-β1，抑制肝Kupffer細胞活化，起到抗肝纖維化的作用［10］。且試驗證實黃芪總黃酮、黃芪多糖、黃芪甲苷、莪術(shù)油、赤芍總苷（芍藥苷）、人參皂苷、阿魏酸鈉均可通過抑TGF-β1/Smad信號通路的激活，下調(diào)TGF-β1、Smad2等蛋白使得HSCs的活化受到抑制［11-12］。此外，F(xiàn)FBJ中動物藥成分如蟲草多糖、鱉甲水煎液均有報道通過調(diào)節(jié)TGF-β1下游信號通路，減少ECM的合成，達到治療肝纖維化的效果［13］。

MAPK能夠通過HSC活化、增殖、凋亡等過程參與肝纖維化的形成與逆轉(zhuǎn)，包括細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、p38 MAPK和c-Junnh2末端激酶（JNK）3大類，是介導信號轉(zhuǎn)導的高度保守調(diào)節(jié)因子。Li等［14］報道黃芪甲苷Ⅳ通過抑制氧化應(yīng)激的產(chǎn)生和相關(guān)的p38MAPK活化來抑制HSC活化，Boye等［15］認為黃芪甲苷可通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad途徑改善肝纖維化和肝細胞癌。

JAK/STAT信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，該通路參與多種細胞的炎性反應(yīng)并調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡，是眾多細胞因子信號轉(zhuǎn)導的共同途徑。動物實驗顯示三七總皂苷能夠降低肝纖維化大鼠血清中AST、ALT的表達，下調(diào)肝組織中α-SMA、TGF-β1的水平，其作用機制可能是通過JAK/STAT信號通路誘導HSCs凋亡，產(chǎn)生抗纖維化作用［16］。

PPAR-γ信號通路是抗肝纖維化的重要信號通路，可維持HSC處于靜止狀態(tài)，一旦PPAR-γ基因被抑制，PPAR-γ的表達減少，HSC轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。此外，還有研究表明，PPAR-γ激動劑可以抑制TGF-β1所誘導的ECM表達上調(diào)，發(fā)揮其抗纖維化作用。成揚和汪美鳳［17］證實黃芪提取物可通過PPAR-γ和RXR信號通路產(chǎn)生抗大鼠肝纖維化的作用。孫利兵［18］發(fā)現(xiàn)含有槲皮素和毛蕊異黃酮的沙苑子黃酮（FAC）能抑制β-catenin的表達而導致Wnt信號通路下游靶細胞PPAR-γ表達增加，進而抑制HSC的增殖。

特異性阻斷PI3K/Akt信號通路能夠抑制HSC的增殖、遷移，促進HSC的凋亡。在本研究中，PI3K-Akt信號通路上富集的核心靶點數(shù)最多，達18個，包括RXRA、MAPK1PIK3CG、IGF1、IL-4、JAK2、KDR等。本研究還發(fā)現(xiàn)了IL-17通路（富集靶點數(shù)11個），Meng等［19］在大量動物實驗研究中發(fā)現(xiàn)，IL-17通過激活KCs和HSCs中的NF-κB/STAT3發(fā)揮促炎和促纖維化作用。NF-κB是不同炎癥因子發(fā)揮促炎反應(yīng)導致纖維化的共同信號通路。楊瑩［20］研究發(fā)現(xiàn)，鱉甲寡肽I-C-f-6能夠上調(diào)炎性抑制因子IL-4、IL-10的表達，抑制腫瘤壞死因子的合成，下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B（NF-κB）的表達，提高機體的抗炎能力。Zhang等［21］發(fā)現(xiàn)木犀草素通過調(diào)控Nrf2/NF-κB/P53通路減輕氯化汞誘導的肝損傷。邵丹陽證實［22］芍藥苷能降低肝纖維化基本指標α-SMA、Collagen-I的表達，有效地抑制促炎因子的釋放，可能通過調(diào)控LXRs-STAT3信號通路改善肝纖維化的發(fā)展進程。Hou等［23］研究顯示，人參皂苷Rb1可通過抑制NF-κB信號通路來完成對炎性反應(yīng)的應(yīng)答，促進HSC凋亡。羅飄等［24］研究表明Rg1通過調(diào)節(jié)NF-κB/VCAM-1信號途徑抑制炎癥損傷，減輕膽汁淤積性肝纖維化。此外，癌癥蛋白多糖在本研究中富集靶點數(shù)也較多（16個靶點），蛋白多糖是一類能連接蛋白骨架的多糖分子，如透明質(zhì)酸酶（HA）、硫酸軟骨素等。HSC活化狀態(tài)下，合成分泌出大量HA，并加劇前膠蛋白合成，而HA可促進膠原白分子的聚集，使肝臟基底骨架不斷纖維化，而促進肝纖維化。

綜上所述，F(xiàn)FBJ抗肝纖維化的過程涉及多條通路、多個靶點以及多個生物過程，其中本研究預(yù)測的MAPK、TGF-β1、PPAR、JAK/STAT信號通路均在理論上得到了驗證，且報道的作用于這些通路的成分可能同樣存在于FFBJ中。而預(yù)測的通路PI3K/Akt、IL-17、癌癥蛋白多糖信號通路也有研究證實是抗肝纖維化的作用通路，但涉及的成分與FFBJ相關(guān)尚未得到證實；成分木犀草素、人參皂苷Rb1、Rg1、芍藥苷、鱉甲寡肽證實可通過NF-κB通路發(fā)揮抗肝纖維化作用，但該通路在本研究中未被預(yù)測到；這些均為未來實驗驗證FFBJ抗纖維化關(guān)鍵靶蛋白及作用機制提供了思路與線索。