鄭璐瑤 陸宇 陳效友

目前，非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)肺病的年患病率逐年增加，據(jù)Ratnatunga等[1]預(yù)測，2020—2040年NTM感染患者將上升至6446例/年。截至目前已經(jīng)鑒定的NTM有190余種，其中有數(shù)十種可使人體致病[2]。NTM對經(jīng)典的抗結(jié)核分枝桿菌藥物反應(yīng)欠佳，總體應(yīng)答率大約為50%[3]，常常導(dǎo)致疾病進(jìn)展和擴(kuò)散。目前臨床上常用的治療方案通常是基于大環(huán)內(nèi)酯類藥物的三藥及三藥以上聯(lián)合治療方案，治療18～24個月[2]，但治療成功率平均也只有66%[4]，并且有一定的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)為耐藥的概率[5]。因此，我們?nèi)孕璨粩嗵剿髋c研究新的可用于抗NTM的藥物及治療方案。尋找新的藥物和方案有兩條途徑：第一條途徑是在目前已有的抗菌藥物中尋找對NTM具有殺滅作用的藥物或化合物，但它們中僅有少部分藥物具有抗NTM活性，且這些藥物或化合物大多還處于臨床前階段，進(jìn)入臨床研究階段的較少。第二條途徑就是開發(fā)新的針對NTM特有靶點(diǎn)的藥物，但由于NTM具有自身特殊的生理特點(diǎn)，且開發(fā)過程也存在重重困難，新藥研發(fā)仍面臨諸多挑戰(zhàn)。

NTM肺病治療藥物的研發(fā)情況

雖然美國胸科學(xué)會和英國胸科學(xué)會已經(jīng)出版了NTM診療指南，但其中推薦的藥物或治療方案在很大程度上還是經(jīng)驗(yàn)性的[5-6]，且沒有針對不同NTM的標(biāo)準(zhǔn)治療方案或有效藥物。所以，我們還需要不斷探索新的可用于NTM肺病的有效藥物并加入到化療方案中。

一、臨床階段藥物

1.利福布汀(rifabutin，Rfb)：Rfb在體外及巨噬細(xì)胞內(nèi)對包括耐藥株在內(nèi)的膿腫分枝桿菌(MABS)[最低抑菌濃度(MIC)為3 μg/ml，最低殺菌濃度(MBC)為6 μg/ml][7]、堪薩斯分枝桿菌和鳥分枝桿菌(MAC)均有抗菌活性[8-9]，它和克拉霉素(clarithromycin，Clr)、替加環(huán)素、乙胺丁醇及亞胺培南具有協(xié)同殺傷作用[10-11]，或許可以組成新的聯(lián)合用藥方案。在MAC小鼠模型中，Rfb并沒有增加莫西沙星、阿奇霉素和乙胺丁醇單藥或藥物聯(lián)合方案的殺菌作用[12]，但在MABS小鼠模型中，Rfb在低濃度時就可以達(dá)到與Clr相同的殺菌效果[13]。此外，Ramis等[14]發(fā)現(xiàn)，Rfb的衍生物Rfb4、Rfb10、Rfb11同樣具有抗MABS的活性，可作為未來藥物研發(fā)的候選化合物。目前，國內(nèi)外正在進(jìn)行幾項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)(NCT00001030、NCT00002101、NCT00001047、NCT04310930、NCT00002122)，評價Rfb對鳥分枝桿菌肺病(MAC-PD)和膿腫分枝桿菌肺病(MABS-PD)的治療效果。

2.氯法齊明(clofazimine，Cfz)：近年的體外研究表明，Cfz對多種NTM具有抗菌活性，其作用機(jī)制被認(rèn)為是抑制分枝桿菌的氧化還原鏈或破壞菌體細(xì)胞膜。大多數(shù)臨床分離株MIC≤1 mg/L(對于快生長群MIC≤1 mg/L；慢生長群MIC≤0.25 mg/L)[15]，并且Cfz可預(yù)防阿米卡星(amikacin，Am)或Clr單藥引起的復(fù)發(fā)。在小鼠模型研究中，Cfz治療能夠顯著降低小鼠肺組織中的細(xì)菌負(fù)荷[16]。在MAC-PD和MABS-PD患者中，聯(lián)合Cfz的治療方案痰培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)率比單藥治療方案高60%以上[17]，在使用過程中幾乎不需要監(jiān)測[18]，故未來或許可以成為NTM治療方案中的一員。目前有兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)(NCT02968212和NCT04310930)分別評估其對MAC-PD和MABS-PD的治療效果。

3.貝達(dá)喹啉(bedaquiline，Bdq)：Bdq屬于一種二芳基喹啉類藥物，通過靶向作用于分枝桿菌的ATP合成酶，阻止分枝桿菌利用ATP產(chǎn)生能量而發(fā)揮抗菌作用。多項(xiàng)體外研究顯示，Bdq在體外環(huán)境下對快速生長和緩慢生長的分枝桿菌均有較好的抗菌活性(MIC在0.03～0.5 μg/ml之間)[19-20]。與單藥相比，Bdq和Cfz的聯(lián)合用藥對MABS和MAC的體外殺菌作用更強(qiáng)[21]。Bdq在小鼠模型中表現(xiàn)為抑菌效果[22]，但Philley等[23]在對難治性MAC-PD和MABS-PD患者的評估中發(fā)現(xiàn)，含Bdq的治療方案在治療后6個月有良好的臨床反應(yīng)。目前關(guān)于Bdq對MABS的作用已進(jìn)行到了Ⅲ期臨床試驗(yàn)(NCT04310930)，今后或許可以作為強(qiáng)有力的抗菌藥物加入到NTM肺病的治療方案中。

4.Am：相比其他氨基糖苷類抗生素而言，Am可以以更小的劑量達(dá)到同樣的殺菌效能，并且作用時間也更長，它對MAC、MABS和其他NTM菌種的臨床分離株顯示出很好的體外活性[24-25]。在C57BL/6J小鼠模型中，Am相比Clr、Bdq、Clr+Am+Bdq三聯(lián)劑具有更強(qiáng)的殺菌活性[22]。臨床試驗(yàn)(NCT01315236和NCT02344004)證明在NTM肺病患者的基線治療方案中加入脂質(zhì)體Am痰菌陰轉(zhuǎn)率更高(32%vs. 9%)[26-27]。目前兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)(NCT00000641和NCT04310930)正在進(jìn)行，以評估其對HIV感染者的彌散性NTM或MABS感染患者的療效。

二、臨床前階段藥物

1.PIPD1和吲哚-2-甲酰胺：PIPD1和吲哚-2-甲酰胺都是分枝桿菌膜蛋白3(mycobacterial membrane protein large 3，MmpL3)的抑制劑，可干擾分枝桿菌細(xì)胞壁的合成。PIPD1對MABS和恥垢分枝桿菌均具有較高活性(MIC為0.125～1 μg/ml，MBC為0.125～0.5 μg/ml)[28-29]；此外，PIPD1還能夠進(jìn)入小鼠和人類巨噬細(xì)胞并阻止細(xì)菌復(fù)制[28]。而在Kozikowski等[30]的研究中，吲哚-2-甲酰胺及其部分先導(dǎo)化合物對MABS的MIC可達(dá)到0.125 μg/ml。目前二者還處于臨床前階段，其治療潛力有待于進(jìn)一步發(fā)掘。

2.惡唑烷酮類抗生素：泰地唑利(tedizolid，TR-700)是一種新型的甲基四唑基惡唑烷酮，它對線粒體蛋白合成有更強(qiáng)的抑制作用[31]，MIC是利奈唑胺的1/2～1/16[32-33]，對一些利奈唑胺耐藥菌株也具有殺菌活性[34]，同時由于利奈唑胺的長期應(yīng)用會導(dǎo)致骨髓毒性增加，故TR-700可能是利奈唑胺的良好替代品[35]。

LCB01-0371是新型惡唑烷酮類抗生素，它在體內(nèi)具有較高的水溶性，并具有良好的吸收、分布、代謝、排泄和較低的毒性。Kim等[36]發(fā)現(xiàn)，LCB01-0371在體外和巨噬細(xì)胞感染模型中對膿腫分枝桿菌有效，同時LCB01-0371還可以抑制Am、頭孢西丁和Clr耐藥的MABS菌株的生長。DA-7867 和DA-7157也是惡唑烷酮類化合物，二者對快生長菌群和慢生長菌群的所有測試菌種的MIC90均<8 μg/ml。對于堪薩斯分枝桿菌和海藻分枝桿菌，二者的MIC90均<0.5 μg/ml[32]。這些結(jié)果證明了這些化合物的抗NTM潛力。

3.β-內(nèi)酰胺類抗生素及β-內(nèi)酰胺酶抑制劑：β-內(nèi)酰胺類抗生素或β-內(nèi)酰胺酶抑制劑中僅有包括亞胺培南、頭孢西丁及阿維巴坦在內(nèi)的少數(shù)藥物對NTM有體外抗菌效果。在體外實(shí)驗(yàn)中，亞胺培南及頭孢西丁均對MABS有殺傷效應(yīng)[37]，而阿維巴坦(4 μg/ml)可將碳青霉烯類抗生素對MABS的MIC降低至1/2～1/32[38-39]。在斑馬魚動物模型中，阿維巴坦也可有效抑制MABS的生長[40]?？梢?，二者聯(lián)合或開發(fā)二者的聯(lián)合制劑治療NTM肺病具有很好的研究價值。

4.SQ-641：是所有新型核苷抗生素capuramycin的類似物中殺菌活性最強(qiáng)的化合物，對于MAC和MABS的MIC均小于1 μg/ml。對于恥垢分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌的MIC在1～4 μg/ml之間[41]。Dubuisson等[42]還證明，SQ-641與乙胺丁醇在MAC和恥垢分枝桿菌中存在協(xié)同作用，其與Rfb和鏈霉素在MABS中存在協(xié)同作用。但目前尚無SQ-641的體內(nèi)殺菌作用的數(shù)據(jù)。

5.CPZEN-45：CPZEN-45可以靶向作用于十一烯基磷酸-GlcNAc-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶(TagO)，從而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成。研究表明，CPZEN-45對于NTM有一定的活性，尤其是緩慢生長型，如MAC，其MIC在0.2～1.56 μg/ml之間[43]。目前關(guān)于CPZEN-45的研究雖然還處于臨床前階段，但是它存在很大的開發(fā)潛能[44-46]，有望在未來成為抗分枝桿菌的新型藥物選擇。

6.D-環(huán)絲氨酸：D-環(huán)絲氨酸是一種氨基酸衍生物，通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的合成，造成細(xì)菌細(xì)胞壁缺損。在Cowman等[47]的研究中，2637株NTM分離株98%以上均對D-環(huán)絲氨酸敏感，Khosravi等[48]發(fā)現(xiàn)D-環(huán)絲氨酸對MABS及偶發(fā)分枝桿菌感染有較好的療效，且可能與Clr存在協(xié)同作用，或許可作為MABS感染治療方案的候選藥物之一。

7.普托馬尼(pretomanid，PA-824)：PA-824是結(jié)構(gòu)上與Bdq相似的前體藥物，它可以同時作用于分枝桿菌細(xì)胞壁及呼吸鏈，對復(fù)制型和非復(fù)制型、厭氧及頑固性分枝桿菌都有抗菌作用[49-50]。但目前PA-824的體外藥效學(xué)評價結(jié)果并不滿意(對堪薩斯分枝桿菌的MIC為12.5 mg/L，潰瘍分枝桿菌為16 mg/L，而對MAC、MABS均大于100 mg/L)[51]，目前也無相關(guān)臨床研究。

8.DC-159a：DC-159a是新一代8-甲氧基氟喹諾酮，它的抗NTM活性是目前可用的氟喹諾酮類藥物中最好的，對堪薩斯分枝桿菌和福特分枝桿菌，MIC分別為0.125 μg/ml和0.25 μg/ml[51]，對MAC的MIC通常是其他氟喹諾酮類藥物的1/2～1/16[52]。但是，它對其他類型的NTM抗菌作用欠佳，并且尚無針對NTM感染的體內(nèi)藥效數(shù)據(jù)。

9.TP-271：TP-271是由Tetraphase Pharmaceuticals(USA)研發(fā)的四環(huán)素類抗生素，具有強(qiáng)大的抗NTM活性，MABS的MIC為0.5 μg/ml；偶發(fā)分枝桿菌的MIC為0.03～0.06 μg/ml[53-54]。但是尚無針對NTM的體內(nèi)療效數(shù)據(jù)。

NTM肺病治療藥物研發(fā)的挑戰(zhàn)

目前，臨床上亟需找到更有效、更安全的藥物或方案，包括具有廣譜抗NTM活性、理想生物利用度的藥物。然而，NTM種類繁多，它們由于自身結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)普遍存在抗藥性，又在致病性、毒力、傳播方式和抗生素敏感性方面各有不同，這些差異甚至可以存在于同一種NTM的不同亞種中。對于這些微生物和它們與人體相互作用機(jī)制的研究尚不充分。由于NTM菌體的特殊性和新藥研發(fā)的諸多難點(diǎn)，這種目標(biāo)并不容易實(shí)現(xiàn)。

一、NTM菌體的特殊性

1.生物膜：NTM會形成一層生物膜，這層生物膜是細(xì)菌附著在體外或體內(nèi)固體表面時形成的膜狀的自我保護(hù)的三維結(jié)構(gòu)[55]，由細(xì)胞外基質(zhì)和微菌落組成[56]。生物膜的存在，給予了細(xì)菌抵御外界不良環(huán)境的屏障，也使得細(xì)菌具備了一定的免疫逃逸能力，即它可以避免細(xì)菌受到宿主的防御系統(tǒng)反應(yīng)和化學(xué)藥物的攻擊，與游離細(xì)菌相比，生物膜內(nèi)細(xì)菌的MIC可高出102～103倍[57]。Fux等[58]研究表明，分枝桿菌在生物膜形成的不均勻的微環(huán)境中異步生長，即存在不對稱細(xì)胞分裂和細(xì)胞間隨機(jī)基因傳播而發(fā)生耐藥。此外，NTM在體內(nèi)生長時，細(xì)胞酪狀碎屑、機(jī)體呼吸系統(tǒng)分泌的黏液及生物膜混合物導(dǎo)致作用于NTM菌體的藥物濃度極低，且促進(jìn)“饑餓”狀態(tài)的NTM減慢代謝甚至休眠，使其對抗菌藥物敏感性進(jìn)一步下降。

2.細(xì)胞壁：同結(jié)核分枝桿菌類似，NTM有復(fù)雜的富含脂質(zhì)的細(xì)胞壁，導(dǎo)致其疏水性強(qiáng)，不利于水溶性藥物進(jìn)入，且細(xì)胞壁上的孔蛋白少，導(dǎo)致細(xì)菌營養(yǎng)供給欠佳、代謝不活躍而對抗生素反應(yīng)差[59]。NTM細(xì)胞壁上還存在可以修飾抗菌藥物及其靶點(diǎn)的系統(tǒng)，以及大量的藥物外排泵，如efp A(RFP)、Ifr A、efp A、Pst B(FQs)、tet V、tap (AGs)等[60-61]，這種內(nèi)在的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可在生理上保護(hù)細(xì)菌免受有毒分子的侵害。

3.其他特點(diǎn)：NTM還有一些特點(diǎn)導(dǎo)致藥物療效不佳。(1)獲得性耐藥和誘導(dǎo)耐藥：獲得性耐藥的分子基礎(chǔ)是基因突變，突變基因編碼的各種酶可通過藥物靶點(diǎn)修飾等途徑來降解抗生素或降低藥物親和力。誘導(dǎo)耐藥的最經(jīng)典的例子就是在一些NTM如MABS中，紅霉素核糖體甲基化酶(erm)可被大環(huán)內(nèi)酯類抗生素誘導(dǎo)表達(dá)，erm能特異性地甲基化23S rRNA的2058位腺嘌呤，導(dǎo)致菌體對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥[60]；(2)在低營養(yǎng)、低氧條件下，NTM可改變?yōu)榉窃鲋碃顟B(tài)，而對藥物呈高耐受性，抗生素不能破壞其細(xì)胞內(nèi)成份[61]；(3)NTM常與HIV等其他病原體合并感染。

二、新藥研發(fā)的挑戰(zhàn)

與結(jié)核病相比，NTM藥品管道非常空缺，迫切需要開發(fā)抗NTM藥品[3]。但是從最初的篩選到最終產(chǎn)品上市是一個復(fù)雜的過程，一種新藥上市平均需要10～15年的時間，超過10億美元才能進(jìn)入藥房[62]，可見，抗NTM的新藥研發(fā)仍存在諸多挑戰(zhàn)。

1.重視和投入不足：NTM感染后起病隱匿，癥狀多類似結(jié)核病或者其他呼吸系統(tǒng)疾病，患者在被診斷為NTM肺病之前通常會有數(shù)年的癥狀，且由于檢測設(shè)備和條件等限制，存在較高的誤診率[63]，故大多數(shù)流行病學(xué)專家對NTM肺病的流行調(diào)查結(jié)果也僅報(bào)告了不完全的患病率數(shù)據(jù)[64]。流行病學(xué)證據(jù)的不足，導(dǎo)致對NTM肺病的重視度和投入還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

2.藥物作用靶點(diǎn)篩選困難：開發(fā)新藥最重要的步驟之一就是作用靶點(diǎn)的識別和驗(yàn)證，也就是說要發(fā)現(xiàn)對NTM有活性的化合物，需要進(jìn)行全基因組測序、突變的篩選和生化分析，并檢索包括出版物和專利信息、基因表達(dá)數(shù)據(jù)、蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)基因表型和化合物譜數(shù)據(jù)在內(nèi)的各種生物學(xué)信息[65]，以發(fā)現(xiàn)有效、安全，同時還要滿足臨床和商業(yè)需求的命中物。當(dāng)藥物作用靶點(diǎn)確定以后，還需要通過化學(xué)基因組學(xué)、轉(zhuǎn)基因、反義核酸技術(shù)等方法對該靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證[62]。而NTM的致病菌種/亞種數(shù)目龐大，想要對每一種菌都進(jìn)行靶點(diǎn)篩選是不可能的，但即使只對高致病率的菌種進(jìn)行篩選也需要投入大量的人力和物力。

3.化合物篩選命中率低：作用靶點(diǎn)驗(yàn)證后就是化合物的篩選環(huán)節(jié)，即從化合物庫中篩選出具有抗NTM活性并且可重復(fù)驗(yàn)證其活性的化合物。篩選方法包括高通量篩選(HTS)、虛擬藥物篩選、結(jié)構(gòu)輔助藥物設(shè)計(jì)、分割片段篩選等[62, 66]，但是命中率卻很低。最近Aziz等[67]對2700種FDA批準(zhǔn)的針對膿腫支原體的藥物進(jìn)行篩選，僅有約1%的命中率。

4.藥理學(xué)評價困難：確定候選藥物以后，就需要在體外和體內(nèi)進(jìn)行藥代動力學(xué)和藥效學(xué)的評價，這在抗NTM藥物研發(fā)過程中又是一大難題。首先，對于NTM來說，評價藥物的殺菌活性時菌種選擇、培養(yǎng)條件等都會影響最終的結(jié)果[68]，并且目前還沒有成熟的體外藥效學(xué)評價方法，利用結(jié)核分枝桿菌體外MIC測定方法來評價抗NTM藥物的藥效學(xué)結(jié)果與實(shí)際臨床療效之間相關(guān)性差。其次，藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)最重要的先決條件之一是能夠獲得模擬人類疾病狀況的動物模型。目前并沒有穩(wěn)定的模型建立方法，使得我們無法通過動物模型評估各種藥物或化合物在NTM感染中的藥效學(xué)。

5.成藥困難：NTM肺病的治療療程一般在1年以上，為了使患者有足夠的依從性，通常最好為口服劑型，還要滿足足夠高的生物利用度及胃腸耐受性。與此同時，大部分抗菌藥物都是經(jīng)肝臟P450酶代謝，為了減少藥物間相互作用及競爭抑制，候選化合物還要根據(jù)代謝途徑進(jìn)行挑選。

展 望

近年來，NTM肺病的發(fā)病率逐漸上升，目前臨床推薦的治療方案雖然總體療效要優(yōu)于經(jīng)典的抗結(jié)核治療方案，但成功率仍然很低，因此需要找到更有效的藥物或藥物組合來對抗NTM感染。若現(xiàn)有藥物不能達(dá)到這些要求，那么就需要研發(fā)新的藥物。目前抗NTM新藥研發(fā)的挑戰(zhàn)主要在于克服NTM先天遺傳和生理特性導(dǎo)致的耐藥現(xiàn)象和研發(fā)過程中的種種困難。面對這些挑戰(zhàn)，一個可能的解決辦法是尋找新的具有協(xié)同作用的藥物組合，但更多的是需要政府部門加大對新藥研發(fā)的投入和科研人員對NTM的生理特性和耐藥機(jī)制的進(jìn)一步研究。雖然目前克服這些挑戰(zhàn)似乎是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，但是不同醫(yī)藥領(lǐng)域的技術(shù)都在不斷進(jìn)步，我們相信，隨著人們對NTM的了解不斷加深，越來越多的研究正在進(jìn)行中，對NTM肺病的重大治療進(jìn)展將在未來幾年中實(shí)現(xiàn)。