馮琳懿

明確胚胎發(fā)育中基因突變及突變來(lái)源情況，不僅利于在遺傳學(xué)因素中查找線索，防止缺陷新生兒的出生，也可為再次妊娠采取針對(duì)性措施提供幫助。然而目前傳統(tǒng)產(chǎn)前檢測(cè)方法，如絨毛活檢、羊膜腔穿刺術(shù)等取材進(jìn)行DNA檢查，對(duì)于孕婦和胎兒均具有一定的損傷，其導(dǎo)致的流產(chǎn)率可達(dá)0.5%～1%[1]，故尋求穩(wěn)定可靠的無(wú)創(chuàng)傷產(chǎn)前基因突變檢測(cè)方法是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一。上世紀(jì)末，Khalil等[2]發(fā)現(xiàn)孕婦血漿中存在微量游離胎兒DNA，這為無(wú)創(chuàng)傷產(chǎn)前基因突變檢測(cè)帶來(lái)了希望。但研究顯示，母體外周血中的游離胎兒DNA多在0.3 kb以下，游離胎兒DNA含量較低帶來(lái)的檢測(cè)靈敏度低的缺點(diǎn)限制了其在臨床上的應(yīng)用[3]。高通量基因測(cè)序(next generation sequencing，NGS)技術(shù)是基因檢測(cè)的新技術(shù)，文獻(xiàn)報(bào)道顯示，NGS技術(shù)輔助以DNA片段化處理技術(shù)在基因染色體異常片段測(cè)序及長(zhǎng)度測(cè)量中具有較高的靈敏度和特異度(均可達(dá)到95%以上)[4]，這給母體游離胎兒DNA檢測(cè)帶來(lái)了技術(shù)保障。軟骨發(fā)育不全和致死性侏儒癥均是胚胎發(fā)育中基因突變后的常見骨骼疾病，年發(fā)病率分別約在3.6～6.4和2.1～5.1，60%以上常見骨骼疾病多因纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體基因突變所產(chǎn)生，且這種基因突變具有典型父源遺傳性[5]。鑒于此，本研究以山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科近期收治的軟骨發(fā)育不全和致死性侏儒癥診斷的孕婦為研究對(duì)象，采用NGS技術(shù)聯(lián)合DNA片段化處理技術(shù)對(duì)母體游離胎兒DNA進(jìn)行基因突變檢測(cè)，并觀察其在篩查胎兒新發(fā)突變或父源遺傳疾病中的應(yīng)用可行性。

資料與方法

一、一般資料

選取2017年1月—12月于山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診的27例孕婦，其孕30～32周超聲提示或既往胎生史為軟骨發(fā)育不良癥和致死性侏儒癥。孕婦年齡在20～35歲，平均年齡(28.7±2.5)歲。其中超聲提示或既往胎生史為軟骨發(fā)育不良癥就診孕婦19例，致死性侏儒癥就診8例。納入研究的孕婦及配偶身體健康，自身無(wú)軟骨發(fā)育不良癥或致死性侏儒癥，無(wú)妊娠期高血壓、糖尿病、脂肪肝等妊娠期合并癥或并發(fā)癥，肝腎功能正常，無(wú)婦科疾病。本研究所有孕婦及家屬對(duì)研究知情且簽訂同意書。

二、方法

1.檢測(cè)方法：27例孕婦均于孕30～32周在超聲引導(dǎo)下羊膜穿刺采集羊水2 mL和外周血20 mL，送實(shí)驗(yàn)室分別進(jìn)行基因組DNA Sanger檢測(cè)和游離胎兒DNA突變檢測(cè)。(1)基因組DNA Sanger檢測(cè)。采用DNA Mini Kit試劑盒(美國(guó)公司ABI公司生產(chǎn))提取胎兒基因組DNA，采用Sanger測(cè)序法行軟骨發(fā)育不良癥和致死性侏儒癥常見突變位點(diǎn)(c.1123、c.1138、c.1130)檢測(cè)[6]，以此基因組DNA Sanger測(cè)序檢測(cè)結(jié)果作為本研究金標(biāo)準(zhǔn)。(2)游離胎兒DNA突變檢測(cè)。首先進(jìn)行母體游離胎兒DNA提取，標(biāo)本順序ID編號(hào)(000-027)，離心血漿(1 600 ram/min, 4 ℃，10 min)，取上清2 mL轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管內(nèi)，采用DNA Nucleic Acid Kit試劑盒(美國(guó)公司ABI公司生產(chǎn))提取母體游離胎兒DNA。(3)游離胎兒DNA片段化處理。采用共聚焦超聲波儀器(型號(hào)：Covaris E210；生產(chǎn)商：澳大利亞Ccorbett全司)對(duì)游離胎兒DNA進(jìn)行片段化處理，目標(biāo)片段跨度150～200 bp，以PCR Clean-Up磁珠碎片化并提純，40 μL緩沖液回溶，采用Bioanalyzer 2100 生物分析儀(生產(chǎn)商：北京東勝創(chuàng)新生物科技)對(duì)游離胎兒DNA 片段進(jìn)行長(zhǎng)度測(cè)定。(4)熒光定量游離胎兒DNA濃度。采用Qubit? 2.0 熒光定量?jī)x(生產(chǎn)商：北京天根生化科技)對(duì)游離胎兒DNA進(jìn)行濃度定量，對(duì)應(yīng)濃度按照10%、6%、3%、1%和0.5%標(biāo)準(zhǔn)，采用高通量染色體測(cè)序(NGS)技術(shù)對(duì)各濃度熒光定量游離胎兒DNA片段進(jìn)行測(cè)序，以100 bp為最低基因序列片段測(cè)試長(zhǎng)度，通過(guò)測(cè)序以對(duì)位點(diǎn)基因片段進(jìn)行拍照。測(cè)序序列結(jié)果以文件形式保存以供評(píng)估。

2.評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：(1)片段化產(chǎn)物測(cè)序分析。將NGS測(cè)序序列結(jié)果與人類基因圖譜進(jìn)行對(duì)比，如DGV、UCSC等數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取母體游離胎兒DNA片段化產(chǎn)物測(cè)序診斷結(jié)果。DGV數(shù)據(jù)庫(kù)軟骨發(fā)育不良癥和致死性侏儒癥波峰分布132.5～158 bp之間[7]。(2)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)分析。NGS測(cè)序測(cè)序完成后，對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，即去掉小于100 bp的序列后生產(chǎn)樣本問(wèn)卷，使用mtools軟件進(jìn)行sort模塊排序，得到對(duì)應(yīng)濃度樣本波形圖獲取縱軸熒光OD值。DGV數(shù)據(jù)庫(kù)軟骨發(fā)育不良癥和致死性侏儒癥的DNA片段的Proton標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間為200～300 bp[8]。(3)NGS測(cè)序突變及突變來(lái)源分析。仔細(xì)觀察突變區(qū)域，對(duì)比DGV數(shù)據(jù)庫(kù)軟骨發(fā)育不良癥和致死性侏儒癥基因序列片段，得出突變區(qū)域和類型。使用iTools軟件的Xamtools對(duì)基因突變片段進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得出對(duì)比區(qū)域位點(diǎn)堿基深度，提取各濃度樣本單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)堿基深度，取最大深度和次大深度，計(jì)算樣品MAF值，當(dāng)MAF<0.1%時(shí)，為純合位點(diǎn)，基因突變來(lái)源為父親基因，當(dāng)MAF>0.1%，為位點(diǎn)基于雜合突變，基因突變來(lái)源為胎兒。

結(jié) 果

一、27例母體游離胎兒DNA片段化產(chǎn)物測(cè)序分析

27例母體游離胎兒DNA(濃度3%)片段化產(chǎn)物集中在143.5 bp區(qū)域，區(qū)域跨度在132.5～158 bp之間，與生理?xiàng)l件下軟骨發(fā)育不良癥和致死性侏儒癥的DNA片段的波峰分布特征吻合。典型病例DNA片段化產(chǎn)物波峰分布見圖1。

Note:The horizontal "Fragment length" indicates the length of DNA fragment in unit bp, while the vertical "Fluorescence unit" indicates the fluorescence OD value.

二、27例母體游離胎兒DNA文件質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)

見圖2，母體游離胎兒DNA濃度分別為10%、6%、3%、1 %和0.5%時(shí)的片段化產(chǎn)物波峰分別為264 bp、263 bp、262 bp、261 bp、272 bp，主要分布于260～272 bp，屬于DGV數(shù)據(jù)庫(kù)DNA片段區(qū)間200～300 bp的標(biāo)準(zhǔn)，符合DNA文件質(zhì)控水平符合Proton質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

Note:The horizontal "Fragment length" indicates the length of DNA fragment in unit bp, while the vertical "Fluorescence unit" indicates the fluorescence OD value.

三、27例母體游離胎兒DNA的NGS測(cè)序突變及突變來(lái)源分析

如表1所示。母體游離胎兒DNA濃度分別為10%、6%、3%時(shí)，NGS測(cè)序共檢出6例基因突變，其中軟骨發(fā)育不良癥4例，致死性侏儒癥2例，檢測(cè)結(jié)果與基因組DNA Sanger測(cè)序突變結(jié)果吻合；母體游離胎兒DNA濃度為1%時(shí)，NGS測(cè)序共檢出3例基因突變，其中軟骨發(fā)育不良癥2例，致死性侏儒癥1例；母體游離胎兒DNA濃度為0.5 %時(shí)，NGS測(cè)序共檢出1例基因突變，為軟骨發(fā)育不良癥。4例軟骨發(fā)育不良癥樣本中，在c.1138位點(diǎn)基因突變峰明顯高于其他位點(diǎn)(母體游離胎兒DNA濃度為10%、6%、3%和1%時(shí))，即胎兒攜帶c.1138>A突變基因，突變來(lái)源于胎兒，典型病例堿基變異分布見圖3(孕婦王某，28周歲，孕周31周，因既往胎兒軟骨發(fā)育不良癥生育史就診檢查)。2致死性侏儒癥樣本c.1138(Chr4 1806119)位點(diǎn)的突變峰變化<0.1%，致死性侏儒癥基因突變來(lái)源為父親基因。

表1 27例母體游離胎兒DNA的NGS測(cè)序突變及突變來(lái)源分析

Note:The longitudinal "SNP Percentage" indicates the proportion of variation at different concentrations of a site, while the transverse"SNP position" is the detection site.

討 論

軟骨發(fā)育不良胎兒在孕11～18周時(shí)采用超聲檢查多無(wú)異常，大多數(shù)在孕中晚期超聲檢查時(shí)才能發(fā)現(xiàn)胚胎骨骼生長(zhǎng)速度明確滯后，故本研究將采血時(shí)間定為30～32孕周[9]。另外，致死性侏儒癥雖然能在孕中期影像學(xué)檢查中出現(xiàn)異常，如胸廓狹窄、四肢短小等，但由于各胎兒母體內(nèi)致死性侏儒癥異常表現(xiàn)特征并無(wú)特異性編制，因此僅以影像學(xué)檢查難以鑒別診斷[10]。本研究通過(guò)對(duì)孕婦外周血微量游離胎兒DNA進(jìn)行基因片段化處理后，采用熒光定量游離胎兒DNA濃度，然后運(yùn)用NGS無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)，初步探討母體游離胎兒DNA檢測(cè)在篩查胎兒骨骼疾病新發(fā)突變或父源遺傳疾病的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)游離胎兒DNA定量濃度高于3%時(shí)，NGS無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)可以準(zhǔn)確的對(duì)胎兒骨骼疾病的突變基因進(jìn)行檢測(cè)，與基因組DNA Sanger測(cè)序法的突變檢查結(jié)果吻合。由此提示，母體游離胎兒DNA檢測(cè)可用于胎兒骨骼疾病新發(fā)突變的檢測(cè)，這已得到文獻(xiàn)研究[11]的證實(shí)。

致死性侏儒癥、軟骨發(fā)育不良癥等骨骼疾病的顯著特征是父源效應(yīng)，即致病基因突變幾乎均來(lái)自于父方隱性基因[12]。研究顯示，當(dāng)父方年齡高于35周歲時(shí)，父方攜帶骨骼疾病隱基因，如c.1123、c.1138、c.1130位點(diǎn)的成骨纖維因子突變基因，其生育后代骨骼疾病風(fēng)險(xiǎn)增加，與25歲以下相比，父親35周歲時(shí)，后代軟骨發(fā)育不良癥和致死性侏儒癥的風(fēng)險(xiǎn)分別增加2.8倍和3.4倍[13]。隨著國(guó)內(nèi)二胎政策全面放開，高齡人群生育意愿有所增加，因此，相關(guān)遺傳疾病產(chǎn)前檢查顯得意義重大。本研究顯示，4例軟骨發(fā)育不良癥樣本中，在c.1138位點(diǎn)基因突變峰明顯高于其他位點(diǎn)(母體游離胎兒DNA濃度為10%、6%、3%和1%時(shí))，即胎兒攜帶c.1138>A突變基因，突變來(lái)源于胎兒。而Li等[14]大樣本研究顯示軟骨發(fā)育不良癥基因突變?cè)匆部蓙?lái)源于父親方，研究中87例軟骨發(fā)育不良癥活生兒中，31例基因突變來(lái)源于父親方，占比高達(dá)35.6%。與本研究結(jié)果有一定的差異，可能原因在于本研究樣本量相對(duì)較小。另外，本研究結(jié)果還顯示，2例致死性侏儒癥樣本在c.1138(Chr4 1806119)位點(diǎn)的突變峰變化<0.1%，故致死性侏儒癥基因突變來(lái)源為父親基因。致死性侏儒癥有兩種類型，即致死性侏儒癥1型和致死性侏儒癥2型，前者胎兒影像學(xué)表現(xiàn)為長(zhǎng)骨短而彎曲，后者胎兒影像學(xué)則表現(xiàn)為長(zhǎng)骨短而直，尤其是后者大都是由父親方c.1138(Chr4 1806119)位點(diǎn)基因突變所至[15-16]。

綜上所述，可將母體游離胎兒DNA檢測(cè)應(yīng)用于其他遺傳性疾病胎兒的基因突變檢測(cè)，但需注意以下幾點(diǎn)：(1)由于游離胎兒DNA在母體中屬于微量(約在0.3 kb以下)，故需進(jìn)行熒光定量游離胎兒DNA濃度，以便于精確處理[17]；(2)多數(shù)實(shí)驗(yàn)室將游離胎兒DNA濃度下限設(shè)定在5%或10%[18-19]，而將母體游離胎兒DNA濃度設(shè)定在3%時(shí)，可盡早查出胎兒基因突變，這具有重要的意義；(3)以母體游離胎兒DNA為檢測(cè)對(duì)象，必須明確致病基因片段分布特點(diǎn)，使母體游離胎兒DNA片段分布盡可能接近致病基因DNA片段分布規(guī)律[20]；(4)在病例納入中，必須排除盡可能多的影響因素。如軟骨發(fā)育不良癥、致死性侏儒癥，妊娠期高血壓、糖尿病、脂肪肝等，才可保障母體背景不受干擾。

綜上所述，雖然本研究樣本量較少，但仍然以真實(shí)樣本進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，初步證實(shí)了母體游離胎兒DNA檢測(cè)在篩查胎兒新發(fā)突變或父源遺傳疾病中的應(yīng)用可行性。即當(dāng)游離胎兒DNA濃度≥3% 時(shí)，母體游離胎兒DNA檢測(cè)在篩查胎兒新發(fā)軟骨發(fā)育不良癥和致死性侏儒癥的基因突變或父源遺傳性中具有較高的質(zhì)控水平和準(zhǔn)確性，以此可類推到其他類型新發(fā)突變或父源遺傳疾病的產(chǎn)前診斷，表明母體游離胎兒DNA檢測(cè)在單基因遺傳疾病產(chǎn)前診斷中具有較好的應(yīng)用前景。