徐 丹，陶永梅，宋 丹，趙冰冰，王 爽，周振興，周 悅

(黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000)

血管內(nèi)皮細胞的主要生理功能是調(diào)節(jié)血管平滑肌張力、抗炎和抗血栓形成，血管內(nèi)皮細胞功能障礙是導致心血管病變的重要因素[1-2]。轉化生長因子-β(TGF-β)具有多重生物學作用，可維持血管壁正常結構，可抗炎、抗癌、保護動脈等；Smad3是TGF-β/Smad3信號通路中TGF-β下游的轉導因子，其表達水平較高會導致血管平滑肌細胞、內(nèi)膜增生，參與動脈粥樣硬化發(fā)病過程[3-4]。蓬子菜總黃酮可通過抑制炎癥反應保護血管內(nèi)皮細胞[5]。本實驗基于TGF-β/Smad3信號通路探討了蓬子菜總黃酮對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)增殖、凋亡的影響，旨在為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1藥物及細胞 蓬子菜總黃酮，純度為75%，由黑龍江中醫(yī)藥大學提供，批號：20130115。HUVECs由南京凱基生物技術有限公司提供。

1.2主要試劑及儀器 1640培養(yǎng)基(美國Hyclon公司)；MTT試劑(Sigma公司)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(卡爾文生物科技有限公司)；TGF-β1、Smad3一抗(美國R&D公司)。CO2恒溫培養(yǎng)箱(Heal Force公司)；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3HUVECs培養(yǎng)及模型建立 將HUVECs放置在含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使用PBS洗滌2遍，加入2 mL消化液(由0.02%的EDTA以及0.25%的胰酶配置)，在37 ℃條件下消化1 min。倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞收縮變圓、細胞間隙增加后，去除消化液，再次加入2 mL的培養(yǎng)基消化終止。觀察細胞貼壁情況，配置細胞懸液，及時更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。實驗分為5組，對照組HUVECs正常培養(yǎng)；模型組及低、中、高濃度蓬子菜總黃酮組均參考文獻[6]方法建立H2O2氧化損傷模型(確定H2O2氧化損傷最佳的濃度為100 μmol/L，培養(yǎng)時間為4 h)，然后模型組常規(guī)培養(yǎng)，低、中、高濃度蓬子菜總黃酮組分別加入12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的蓬子菜總黃酮培養(yǎng)。

1.4檢測指標及方法

1.4.1細胞增殖檢測 采用MTT法檢測細胞增殖情況：各組細胞培養(yǎng)24 h，摒棄96孔培養(yǎng)皿中的上清液，每孔中加入20 μL MTT(5 g/L)，在37 ℃環(huán)境中孵育4 h，棄掉上清液，每孔中再次加入200 μL的DMSO溶液，在37 ℃環(huán)境中搖床震蕩10 min，通過全自動酶標儀在490 nm位置觀察吸光度(A)。樣本計數(shù)選擇300個細胞，細胞增殖率=增殖細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.4.2細胞凋亡染色觀察 各組HUVECs在25 cm2培養(yǎng)瓶中進行接種培養(yǎng)，長至70%，刺激48 h后加入TE對細胞進行消化和收集，加入PBS洗滌后，使用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光黃以及碘化丙啶對細胞進行標記，室溫避光孵育15 min，采用流式細胞儀檢測HUVECs凋亡情況。AO/EB染色，在熒光顯微鏡下觀察，樣本計數(shù)選擇300個細胞。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.4.3氧化應激、血管功能相關指標檢測 同實驗1.3處理細胞后，取各組細胞上清液，加入96孔板，用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至最適濃度(1～10 μg/mL)，每凹孔加0.3 mL，4 ℃過夜，或37 ℃水浴3 h，貯存于冰箱中。移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液(含0.05%吐溫-20)洗3次，每次5 min。每凹孔加入0.2 mL用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標本，37 ℃作用1～2 h。移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液(含0.05%吐溫-20)洗3次，每次5 min。加入0.2 mL用稀釋緩沖液稀釋的酶標記特異性抗體溶液，37 ℃作用1～2 h或由預試實驗確定作用時間。移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液(含0.05%吐溫-20)洗3次，每次5 min。加入0.2 mL底物溶液于每個凹孔(OPD或OT)，室溫作用30 min(另設一空白對照，0.4 mL底物加0.1 mL終止劑),每凹孔加2 mol/L H2SO4或2 mol/L 檸檬酸0.05 mL終止反應。用酶標比色計測定492 nm處OD值。

1.4.4TGF-β/Smad3信號通路相關蛋白檢測 采用Western blot檢測:同1.3方法處理細胞后，取各組細胞上清液，10 000×g離心處理10 min，BCA進行蛋白定量檢測，在2×SDS凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，在100 ℃環(huán)境中加熱5 min(有助于蛋白發(fā)生變性)。凝膠電泳完轉膜，取膜，4 ℃環(huán)境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理1 h，使用0.05%～0.1% TBST稀釋一抗(TGF-β1、Smad3一抗為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次5 min，使用0.05%～0.1% TBST稀釋二抗(1∶10 000)，搖動孵育1 h，再次采用TBST連續(xù)洗膜3次，每次5 min。DAB顯色，定量分析蛋白表達情況，以GAPDH為內(nèi)參。

2 結 果

2.1各組HUVECs增殖、凋亡情況 模型組及各濃度蓬子菜總黃酮組細胞增殖率均明顯低于對照組(P均<0.05)，凋亡率均明顯高于對照組(P均<0.05)；模型組細胞增殖率、凋亡率與低濃度蓬子菜總黃酮組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；中濃度和高濃度蓬子菜總黃酮組細胞增殖率均明顯高于模型組和低濃度蓬子菜總黃酮組(P均<0.05)，凋亡率明顯低于模型組和低濃度蓬子菜總黃酮組(P均<0.05)；高濃度蓬子菜總黃酮組增殖率高于中濃度蓬子菜總黃酮組(P<0.05)，凋亡率明顯低于中濃度蓬子菜總黃酮組(P<0.05)。見表1。

2.2各組HUVECs凋亡染色情況 對照組內(nèi)皮細胞形態(tài)正常，表現(xiàn)為綠色彌散狀；模型組凋亡的細胞表現(xiàn)為紅色、橘紅色，細胞核染色質(zhì)發(fā)生固縮、碎裂，伴隨凋亡小體出現(xiàn)；各濃度蓬子菜總黃酮組凋亡細胞數(shù)量均有不同程度減少，其中高濃度蓬子菜總黃酮組最明顯。見圖1。

2.3各組HUVECs中氧化應激、血管功能指標水平 模型組及各濃度蓬子菜總黃酮組SOD、CGRP水平均明顯低于對照組(P均<0.05)，MDA、ET-1水平均明顯高于對照組(P均<0.05)；各濃度蓬子菜總黃酮組SOD、CGRP水平均明顯高于模型組(P均<0.05)，MDA、ET-1水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；中、高濃度蓬子菜總黃酮組SOD、CGRP水平均明顯高于低濃度蓬子菜總黃酮組(P均<0.05)，MDA、ET-1水平均明顯低于低濃度蓬子菜總黃酮組(P均<0.05)；高濃度蓬子菜總黃酮組SOD、CGRP水平均明顯高于中濃度蓬子菜總黃酮組(P均<0.05)，MDA、ET-1水平均明顯低于中濃度蓬子菜總黃酮組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞中SOD、MDA、ET-1、CGRP水平比較

2.4各組HUVECs中TGF-β/Smad3信號通路相關蛋白表達情況 模型組及各濃度蓬子菜總黃酮組TGF-β1蛋白表達量均明顯低于對照組(P均<0.05)，Smad3蛋白表達量均明顯高于對照組(P均<0.05)；各濃度蓬子菜總黃酮組TGF-β1蛋白表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)，Smad3蛋白表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)；中、高濃度蓬子菜總黃酮組TGF-β1蛋白表達量均明顯高于低濃度蓬子菜總黃酮組(P均<0.05)，Smad3蛋白表達量均明顯低于低濃度蓬子菜總黃酮組(P均<0.05)；高濃度蓬子菜總黃酮組TGF-β1蛋白量明顯表達高于中濃度蓬子菜總黃酮組(P<0.05)，Smad3蛋白表達量明顯低于中濃度蓬子菜總黃酮組(P<0.05)。見表3及圖2。

圖2 Western blot檢測各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞中TGF-β1、Smad3蛋白表達情況

表3 各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞中TGF-β1、Smad3蛋白表達量比較

3 討 論

內(nèi)皮細胞增殖、凋亡處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，當內(nèi)皮細胞過度凋亡時會導致內(nèi)皮功能失調(diào)，內(nèi)皮細胞損傷，引發(fā)血管疾病[7-8]。本實驗結果顯示，模型組細胞增殖率較低，細胞凋亡率較高，說明內(nèi)皮細胞損傷后細胞增殖被抑制，促進細胞凋亡；中、高濃度蓬子菜總黃酮組細胞增殖率均有不同程度的提高，細胞凋亡率有不同程度的降低，且高濃度蓬子菜總黃酮組效果更明顯。說明蓬子菜總黃酮能抑制內(nèi)皮細胞損傷凋亡，促進其增殖，有劑量依賴關系，與薛鳳等[9]研究結果一致。

氧化應激反應會影響血管內(nèi)皮細胞增殖，促進多種血管活性物質(zhì)釋放，是導致血管內(nèi)皮細胞損傷的重要原因[10]。SOD可促進細胞內(nèi)活性氧物質(zhì)清除，從而維持細胞氧化與抗氧化平衡；MDA參與細胞脂質(zhì)過氧化過程，可反映細胞氧化損傷嚴重程度[11-12]。蓬子菜總黃酮是蓬子菜中主要的生物活性成分，其可通過清除自由基，增強抗氧化酶活性起到抗氧化作用[6]。本實驗結果顯示，各濃度蓬子菜總黃酮組SOD水平均明顯高于模型組，MDA水平均明顯低于模型組，且高濃度蓬子菜總黃酮組改善更明顯。證實蓬子菜總黃酮能明顯減輕氧化應激反應，且呈濃度依賴，與張紫陽等[13]研究結果一致。

ET屬于一種縮血管活性物質(zhì)，ET-1主要由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，其表達水平過高，會導致血管痙攣，引起組織缺氧缺血，是內(nèi)源性損傷因子；CGRP是一種舒血管生物活性多肽，對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)有重要調(diào)節(jié)作用，是內(nèi)源性保護因子[14-15]。本實驗結果顯示，各濃度蓬子菜總黃酮組CGRP水平均明顯高于模型組，ET-1水平均明顯低于模型組，且高濃度蓬子菜總黃酮組改善更明顯。說明蓬子菜總黃酮能呈濃度依賴性改善血管功能。

TGF-β1/Smads信號轉導途徑與動脈粥樣硬化有密切關系，TGF-β1通過Smad3介導參與動脈粥樣硬化病理過程,Smad3與TGF-β介導的細胞增殖與凋亡、免疫監(jiān)督與心血管發(fā)育等有緊密的聯(lián)系[16-17]。張小卿等[18]以5J/cm2UVA輻射HDMEC建立紫外線光損傷的人真皮微血管內(nèi)皮細胞模型,模型對照組細胞凋亡數(shù)顯著上升,細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β、Smad2/3表達降低，桃紅四物湯含藥血清能有效保護UVA誘導的真皮微血管內(nèi)皮細胞損傷,其機制可能與激活TGF-β/Smad信號通路有關。本實驗結果顯示，各濃度蓬子菜總黃酮組TGF-β1蛋白表達量均明顯高于模型組，Smad3蛋白表達量均明顯低于模型組，且高濃度蓬子菜總黃酮組改善更明顯。說明蓬子菜總黃酮能激活調(diào)控TGF-β/Smad3信號通路，保護內(nèi)皮細胞。

綜上所述，蓬子菜總黃酮能促進HUVECs增殖，抑制其凋亡，可通過調(diào)控TGF-β/Smad3信號通路，減輕細胞氧化應激反應，改善血管功能，從而對HUVECs起到保護作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。