任曉蕾，線金珠，何 翔，左文麗，關(guān)貴彬，霍金海

(1黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036；2多多藥業(yè)有限公司·黑龍江 佳木斯 154007)

五加生化膠囊為2020版《中國(guó)藥典》收載獨(dú)家品種[1]，由川芎、當(dāng)歸、干姜、桃仁、刺五加浸膏、甘草6味中藥組成，具有益氣養(yǎng)血、活血祛瘀，適用于經(jīng)期及人流術(shù)后產(chǎn)后氣虛血瘀，小腹疼痛按之不減，腰背酸痛、心悸氣短等癥[2-5]。目前該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)刺五加浸膏中成分建立含量測(cè)定方法，為單一藥材指標(biāo)性成分定量方法，具有一定片面性。中藥質(zhì)量控制需針對(duì)其組分及組分中的各有效成分含量的合理配比做進(jìn)一步研究，中藥指紋圖譜能反映中藥可測(cè)成分的整體質(zhì)量信息， 整體評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性[6-10]。本文采用HPLC法建立五加生化膠囊指紋圖譜，以溯源的方式對(duì)五加生化膠囊質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格把控。

1 材料

1.1 試藥 五加生化膠囊：多多藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1812231、1904221、1905121、1906151、1906291、1905101、1905061、1907061、1812261、1908101]。綠原酸(110753-201817)、刺五加苷E(C-008-160606)、異嗪皮啶(Y-027-170328)、紫丁香苷(111574-200603)、甘草酸單銨鹽(110731-201619)、藁本內(nèi)酯(RFS-G01001909016)、原兒茶酸(Y-031-140801)、川芎嗪(RFS-C04511812016)：成都彼斯特生物科技有限公司。甲醇(色譜純)：Dikma公司；磷酸(色譜純)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；KQ-300DB數(shù)控超聲儀：昆山市超聲儀器有限公司；BP211D 型電子天平：德國(guó)Sartorius公司；BSAZ24S-CW型電子天平：賽多利斯； ATC2-5-U 超純水機(jī)：美國(guó)艾科浦國(guó)際有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil 100-5C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸；洗脫梯度(0～18 min，7%～27%A；18～22 min，27%A；22～26 min，27%～28%A；26～29 min，28%～31%A；29～33 min，31%～36%A；33～37 min，36%～42%A；37～45 min，42%～52%A；45～52 min，52%～73%A；52～65 min，73%～76%A；)；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；體積流量：0.8 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量10μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 分別取綠原酸、刺五加苷E、紫丁香苷、甘草酸單銨鹽、藁本內(nèi)酯、原兒茶酸及洋川芎內(nèi)酯I，加甲醇制成每1 mL各含0.2 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取五加生化膠囊內(nèi)容物1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)：1812231)，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。以11號(hào)峰(紫丁香苷)為參照峰，結(jié)果各共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD分別小于1%及2%，儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批五加生化膠囊樣品(批號(hào)：1812231)，按“2.1”項(xiàng)下供試品制備方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以11號(hào)峰(紫丁香苷)為參照峰，6 份供試品溶液中藥指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值小于1%，相對(duì)峰面積RSD值小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份“2.3”項(xiàng)下五加生化膠囊供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，供試品溶液制備完成后第0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。以11號(hào)峰(紫丁香苷)為參照峰，供試品溶液在制備后24 h內(nèi)指紋圖譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值小于1%，相對(duì)峰面積RSD值小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜建立 取10批五加生化膠囊，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2012年版，對(duì)10批樣品進(jìn)行圖譜分析和相似度評(píng)價(jià)，采用平均數(shù)法，多點(diǎn)校正后經(jīng)全譜峰匹配，自動(dòng)匹配生成對(duì)照?qǐng)D譜R，計(jì)算相似度。得到五加生化膠囊HPLC指紋圖譜共有色譜峰24個(gè)，其中峰4、10、11、14、16、20、21、24分別與原兒茶酸、綠原酸、紫丁香苷、刺五加苷E、洋川芎內(nèi)脂I、洋川芎內(nèi)脂A、藁本內(nèi)脂、甘草酸單銨鹽對(duì)照品峰的保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)，且紫外光譜圖一致，混合對(duì)照品色譜圖與五加生化膠囊樣品圖見(jiàn)圖1，以11號(hào)峰(紫丁香苷)為特征峰，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表1、圖2，10批樣品的相似度在0.885～0.951之間，僅1批相似度小于0.9，說(shuō)明10批樣品相似度差異較小。

表1 10批樣品相似度

圖1 共有峰色譜圖(4.原兒茶酸；10.綠原酸；11.紫丁香苷；14.刺五加苷E；16.洋川芎內(nèi)脂I；21.藁本內(nèi)脂；24.甘草酸單銨鹽)

圖2 10批五加生化膠囊HPLC指紋圖譜

對(duì)五加生化膠囊樣品與單味藥進(jìn)行比較分析，1號(hào)峰歸屬于干姜，3、4、6、7、9、13、17號(hào)峰歸屬于刺五加，18、24號(hào)峰歸屬于甘草，19～23號(hào)峰歸屬于川芎， 2號(hào)峰來(lái)自于刺五加和川芎，5、12、16號(hào)峰來(lái)自于刺五加和當(dāng)歸，8號(hào)峰由刺五加、當(dāng)歸、川芎和桃仁共同提供，10號(hào)峰來(lái)自于刺五加、當(dāng)歸、川芎和甘草，11號(hào)峰來(lái)自于刺五加和桃仁，15號(hào)峰來(lái)自于當(dāng)歸和川芎。

3 討論

3.1 提取溶劑考察 采用25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇、乙醇進(jìn)行樣品提取，分析圖譜可見(jiàn)復(fù)方中成分可在50%甲醇提取液中得到較好的體現(xiàn)，出峰數(shù)目較其他提取溶劑多，因此選擇50%甲醇作為供試品制備的提取溶劑。

3.2 流動(dòng)相的選擇及波長(zhǎng)考察 通過(guò)考察0.1%甲酸-甲醇、0.1%醋酸-甲醇、0.1%磷酸-甲醇、0.1%磷酸-乙腈等流動(dòng)相，甲醇水系統(tǒng)表現(xiàn)出樣品的峰貌，但對(duì)于多數(shù)有機(jī)酸類成分需要在一定的酸性條件下促進(jìn)樣品中成分的游離，達(dá)到分離檢出的目的，本系統(tǒng)使用磷酸作為水相，在0.1%濃度下既能達(dá)到最佳分離效果，故流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸梯度洗脫。

鑒于樣品制備工藝，分析五加生化膠囊供試品中主要含有苷類、皂苷、有機(jī)酸等易溶于水的成分，此類成分紫外吸收較弱，為將其成分全貌較好的表現(xiàn)出來(lái)，故選用短波長(zhǎng)處進(jìn)行觀察，預(yù)實(shí)驗(yàn)中波長(zhǎng)考察同樣發(fā)現(xiàn)當(dāng)吸收波長(zhǎng)大于270 nm時(shí)，峰數(shù)明顯減少。

3.3 流速、柱溫選擇 分別考察流速0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min下色譜出峰情況，流速0.8 mL/min時(shí)色譜峰峰形適中，分離度好，色譜峰的數(shù)目多；因此選擇本研究流速為0.8 mL/min?？疾熘鶞?0 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃下色譜出峰情況，柱溫35 ℃時(shí)色譜峰峰形適中，分離度好，峰個(gè)數(shù)多，因此選擇35 ℃為柱溫。

本研究采用HPLC法建立五加生化膠囊的指紋圖譜，方法簡(jiǎn)單、快捷，能全面反映五加生化膠囊的質(zhì)量，為全面控制其質(zhì)量提供了重要參考依據(jù)。