程變巧 黃志騰 林園香

原發(fā)性肝癌是嚴(yán)重危害人類健康的第4大惡性腫瘤之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，每年仍有一定的比例發(fā)生[1-2]。目前研究認(rèn)為肝癌的發(fā)生離不開炎癥和癌細(xì)胞的免疫逃逸[3]，慢性炎癥通過抑制免疫監(jiān)測(immunosurveillance)來促進(jìn)癌癥產(chǎn)生。因肝癌中常見原因是慢性乙型病毒性肝炎，因此提出沒有炎癥，就沒有腫瘤的假說。在我國，慢性乙型病毒性肝炎—肝硬化—肝癌仍是肝癌發(fā)生的三部曲。肝臟內(nèi)的炎癥一般經(jīng)過5年左右就會向肝硬化、肝癌的方向發(fā)展。其中炎癥可以啟動肝星狀細(xì)胞的活化[4-6]，后者可以引起肝硬化和肝癌。因此抑制肝星狀細(xì)胞的活化可望降低肝癌的發(fā)生。本課題通過改變肝星狀細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系，觀察對肝癌的炎癥和免疫的影響，預(yù)期為肝癌的生物學(xué)治療提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人源LX-2及SMMC7721細(xì)胞株均由孟超肝膽醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈，本課題在本中心完成。用含有10%胎牛血清(ExCell FND500)+1%雙抗(Hyclone SV30010)的DMEM(Hyclone SH30022.01)高糖培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)生長情況進(jìn)行傳代。

把LX-2肝星狀細(xì)胞系以3×105個(gè)/孔接種于六孔板中12 h后，加入10μg/L TGF-β1[4]24 h后，離心，收集上清液，并加入到預(yù)先生長率達(dá)60%的SMMC7721細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入Disitetide(HY-P0118)12 h后進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2 EILSA檢測 按照操作說明書，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測白細(xì)胞介素-8(IL-8)與白細(xì)胞介素-10(IL-10)的表達(dá)。取外周血2 000 rpm離心10 min，取上清液待檢。具體步驟如下，加樣：每個(gè)血清樣本設(shè)置3個(gè)孔，每孔加標(biāo)準(zhǔn)液100μL，37℃放置40 min；洗板：洗滌液洗4～6次，濾紙上印干(下同)；加蒸餾水25μL，一抗25μL，充分混勻后37℃放置20 min；洗板：同上；每孔加酶標(biāo)抗體100 U 37℃放置10 min；洗板：同上；每孔加底物100μL于37℃暗處15 min；加100μL終止液混勻；30 min內(nèi)在酶標(biāo)儀450 nm處測吸光值(OD值)。

1.3 流氏細(xì)胞術(shù) 單細(xì)胞懸液制備：分別取SMMC7721、LX-2＋SMMCM7721、Disitetide+LX-2＋SMMCM7721細(xì)胞，進(jìn)行胰酶終止消化、離心以及PBS洗滌后，棄去上清液，用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/100μL，取100μL細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。表面染色：加入FITC標(biāo)記抗人CD4、PE標(biāo)記抗人CD25各20μL于上述細(xì)胞中，輕輕渦旋，4℃避光孵育30 min；胞內(nèi)染色：每管加入1 mL 1xFix/Perm(破膜固定劑)工作液，渦旋3 s，避光4℃孵育40～50 min；再加入1 mL 1xPerm/Wash，350 g，4℃，離心6 min，棄上清液；每管加入100μL PBS重懸細(xì)胞；上流式細(xì)胞儀(BD FACSVerse)檢測CD4+、CD25+細(xì)胞比例。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(±s)表示，計(jì)量資料數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1誘導(dǎo)LX-2活化上調(diào)α-SMA表達(dá)

用10μg/L TGF-β1刺激LX-2細(xì)胞，用α-SMA的表達(dá)情況觀察LX-2的活化程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在用10μg/L TGF-β1組α-SMA基因和蛋白表達(dá)水平均較0μg/L TGF-β1表達(dá)水平高，且兩組間比較，P＜0.05。結(jié)果提示TGF-β1刺激LX-2細(xì)胞的活化。見圖1。

圖1 TGF-β1誘導(dǎo)LX-2活化后上調(diào)α-SMA表達(dá)。

2.2 活化的LX-2與SMMC7721細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)肝癌的炎癥反應(yīng) 活化的LX-2細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞共培養(yǎng)后，用肝星狀細(xì)胞抑制劑Disitetide處理共培養(yǎng)細(xì)胞，觀察LX-2對SMMC7721炎癥反應(yīng)的影響，結(jié)果見表1。在共培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)IL-8與IL-10表達(dá)水平均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，與SMMC7721比較，P均＜0.05。隨后用TGF-β1抑制劑Disitetide處理共培養(yǎng)細(xì)胞，隨后發(fā)現(xiàn)IL-8與IL-10表達(dá)水平均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，三組間比較，P均＜0.05。這說明肝星狀細(xì)胞的活化程度調(diào)控著肝癌的炎癥反應(yīng)。

表1 炎癥介質(zhì)在活化的LX-2與SMMC7721共培養(yǎng)體系中表達(dá)(±s) 單位：μmol/L

表1 炎癥介質(zhì)在活化的LX-2與SMMC7721共培養(yǎng)體系中表達(dá)(±s) 單位：μmol/L

注：IL-8和IL-10組各組間比較，P＜0.05。

項(xiàng)目 SMMC7721 LX-2+SMM C7721 干預(yù)組 F值 P值?IL-8 21.83±0.42 41.50±1.43 25.44±0.93 318.72＜0.001 IL-10 19.2±0.29 24.99±0.11 21.65±0.33 368.32＜0.001

2.3 活化的LX-2和SMMC7721細(xì)胞共培養(yǎng)可以促進(jìn)肝癌的免疫反應(yīng) 活化的LX-2細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞共培養(yǎng)后，用肝星狀細(xì)胞抑制劑Disitetide處理共培養(yǎng)細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)觀察CD4+CD25+T細(xì)胞處理前后的表達(dá)變化。結(jié)果見圖2，在共培養(yǎng)細(xì)胞中CD4+CD25+T細(xì)胞(1.57%)較SMMC7721細(xì)胞中表達(dá)(0.46%)明顯增加(P＝0.003)；在Disitetide干預(yù)后表達(dá)稍有下降(1.2%)，與共培養(yǎng)組比較，P＝0.025；與SMMC7721組比較，P＝0.130。從上述結(jié)果表明，活化的LX-2細(xì)胞可以上調(diào)SMMC7721細(xì)胞的免疫活性。

圖2 活化的LX-2和SMMC7721細(xì)胞共培養(yǎng)后上調(diào)CD4+CD25+T細(xì)胞的表達(dá)

3 討論

腫瘤微環(huán)境(TME)是腫瘤細(xì)胞賴以生存和發(fā)展的復(fù)雜環(huán)境，而HCC的慢性炎癥是復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境的重要組成成分之一，其中包括炎癥/免疫細(xì)胞和介質(zhì)。因此推測，HCC轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為和惡性預(yù)后可能被局部的炎癥狀態(tài)所決定。最近越來越多的證據(jù)也提示，在肝癌形成過程中，炎癥/免疫細(xì)胞活化，并相互協(xié)作，獲得促瘤活性，從而導(dǎo)致腫瘤的惡性后果。在這些成分中肝星狀細(xì)胞(HSCs)是免疫微環(huán)境中不可或缺的一種炎癥細(xì)胞，HSC的活化，引起一些活化信號分子如：轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、肝細(xì)胞生長因子(HGF)和血小板源性生長因子(PDGF)的表達(dá)增加，在腫瘤發(fā)展和纖維化過程中起到重要作用。與各種免疫活性細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞相互作用，發(fā)揮其促瘤作用[7-8]。

優(yōu)化微環(huán)境或可暫緩肝癌必死之局[9]。如何調(diào)控肝癌的腫瘤微環(huán)境是目前研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。基于HSC在肝癌中的作用特點(diǎn)，本課題通過調(diào)控HSC的活性表達(dá)來觀察肝癌微環(huán)境中炎癥和免疫變化。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們首先用TGF-1誘導(dǎo)LX-2的活化，進(jìn)而對活化的LX-2細(xì)胞進(jìn)行血清收集，進(jìn)而與SMMC7721細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。分別用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA技術(shù)觀察了共培養(yǎng)體系中LX-2對SMMC7721炎癥免疫的改變情況。IL-8和IL-10是巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與分化，參與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，是目前公認(rèn)的炎癥與免疫抑制因子。研究認(rèn)為CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞主要抑制腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，引起腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[10-12]。我們課題組研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在LX-2刺激的共培養(yǎng)組，IL-8和IL-10的表達(dá)水平均較SMMC7721肝癌細(xì)胞組表達(dá)上調(diào)，CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中比例也明顯升高。為了進(jìn)一步探討LX-2對SMMC7721的調(diào)控機(jī)制，我們用TGF-β1抑制劑Disitetide處理共培養(yǎng)細(xì)胞，目的是抑制LX-2的活化觀察共培養(yǎng)體系中炎癥免疫的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干預(yù)后的IL-8和IL-10的表達(dá)水平較干預(yù)前表達(dá)下降，較SMMC 7721肝癌細(xì)胞組表達(dá)下調(diào)不顯著(P＝0.130)，CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中比例較共培養(yǎng)組也明顯下降。這說明阻斷TGF-β1信號通路可能是阻斷Treg功能以增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)的有效策略[13-15]。從上述結(jié)果中初步說明活化的LX-2細(xì)胞對肝癌細(xì)胞SMMC7721具有顯著的促進(jìn)炎癥反應(yīng)的提高免疫抑制作用，從而影響著肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。

基于上述的研究結(jié)果，我們已經(jīng)明確肝癌體內(nèi)存在免疫和炎癥發(fā)應(yīng)，HSC活化對肝癌的上述機(jī)制具有促進(jìn)作用。但活化的HSC是如何調(diào)控肝癌微環(huán)境中的炎癥和免疫的，對肝癌增生、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制不明。下一步有望對肝癌炎癥和免疫的調(diào)控機(jī)制的研究來揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)功能。