侯云鶴 楊少朋 于超 張學(xué)艷

慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)屬于慢性進(jìn)行性肺部疾病，具有氣流受限不完全可逆的特點(diǎn)，其發(fā)病因素與感染、吸煙以及氧化應(yīng)激等有關(guān)，顆粒吸入以及氣道炎性反應(yīng)在慢阻肺疾病進(jìn)展中具有重要意義。香煙燃燒產(chǎn)生的氧化物質(zhì)可以誘發(fā)脂類以及細(xì)胞膜成分發(fā)生過氧化激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞細(xì)胞內(nèi)DNA，引起組織細(xì)胞損傷。慢阻肺產(chǎn)生炎癥反應(yīng)特點(diǎn)表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞水平升高，中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎性因子水平增加會(huì)加重肺部細(xì)胞的炎癥反應(yīng)與組織損傷。乙酰膽堿可以緩解氣道上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞釋放炎性因子，可能與毒蕈堿受體有關(guān)，例如噻托溴銨為毒蕈堿乙酰膽堿型受體，不僅可以舒張氣道平滑肌，還可以減輕氣道炎癥及肺功能[1]。格隆溴銨是新式長效毒蕈堿受體拮抗劑，對(duì)慢阻肺患者的治療效果明顯[2-3]，但有關(guān)格隆溴銨的作用機(jī)制研究較少。因此，本文通過制備慢阻肺大鼠模型，探索格隆溴銨對(duì)慢阻肺大鼠氣道炎癥與肺組織的影響以及可能存在的作用機(jī)制，為慢阻肺臨床用藥提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器 格隆溴銨(赫澎上海生物科技有限公司)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)ELISA KIT(上海信帆生物科技有限公司)，角質(zhì)形成細(xì)胞衍生趨化因子(keratinocyte-derived chemokine，KC)ELISA KIT(上海奧陸生物科技有限公司)、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)ELISA KIT(上海晶抗生物工程有限公司)、兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1(matrix metalloproteinase inhibitor-1，TIMP-1)抗體(武漢菲恩生物科技有限公司)，顯微鏡(Ti2-U，NIKON)，切片機(jī)(HM 340E，賽默飛)，超聲霧化器(S-888E，南京道芬電子有限公司)。

1.2 動(dòng)物及分組 SPF級(jí)SD雄性健康大鼠30只，4～5周齡，體質(zhì)量190～210 g，購于南方醫(yī)科大學(xué)，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2016-0041，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，溫度20～25℃，濕度40%～50%，人工光照晝夜時(shí)間各12 h，飲水自由。采用隨機(jī)數(shù)字表將SD大鼠均分為對(duì)照組、模型組、干預(yù)組，每組各10只。研究時(shí)間為2019年3月至6月。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 模型制備[4]以及給藥方法[5-6]：將模型組、干預(yù)組大鼠于造模第1天、第14天時(shí)麻醉，插入氣管，向氣管內(nèi)注入LPS 200μg/200μL，將大鼠左右旋轉(zhuǎn)，使LPS進(jìn)入大鼠肺組織，對(duì)照組注入等體積的生理鹽水；于2～12 d、15～28 d時(shí)，模型組、干預(yù)組大鼠置于密閉箱中進(jìn)行煙熏，每日熏15支煙，每天煙熏5次，每次持續(xù)30 min，對(duì)照組除不作煙熏處理外，其余操作相同；干預(yù)組大鼠在2～12 d、15～28 d階段進(jìn)行煙熏前30 min，根據(jù)格隆溴銨成年人使用的最大劑量以及大鼠、成人藥物折算系數(shù)(W)6.25進(jìn)行換算，將格隆溴銨8μg溶于10 mL生理鹽水，采用大鼠霧化給藥儀進(jìn)行霧化吸入治療10 min，模型組吸入等體積的生理鹽水。

1.4 指標(biāo)檢測 各組大鼠于實(shí)驗(yàn)第29天時(shí)開始進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測，1%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉處死各組大鼠，開胸，右下葉肺進(jìn)行結(jié)扎，注入無菌預(yù)冷PBS進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，灌洗3次，灌洗液于4℃2 500 r/min離心10 min，收集上清用于ELISA法檢測TNF-α、KC、GSH含量，操作流程按照試劑盒說明書進(jìn)行，沉淀進(jìn)行劉氏染色液，用于白細(xì)胞計(jì)數(shù)分類。大鼠開胸后，取一部分左肺迅速置于液氮中，于-80℃超低溫冰箱保存，用于肺組織中蛋白、基因表達(dá)量檢測；另一部分左肺置于4%甲醛中性溶液中固定，用于肺組織病理結(jié)構(gòu)觀察。

1.4.1 HE染色 取已固定大鼠肺組織用于常規(guī)石蠟切片，蘇木精、伊紅染色、脫水、透明、固定封片，顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)變化以及組織炎癥浸潤情況，參照文獻(xiàn)等[7]對(duì)氣管、血管、肺間質(zhì)周圍炎性組織浸潤程度進(jìn)行評(píng)分，每個(gè)視野中炎癥細(xì)胞數(shù)目為0視為無炎癥(0分)、每個(gè)視野中炎癥細(xì)胞數(shù)目＜10個(gè)視為輕度炎癥(1分)、每個(gè)視野中炎癥細(xì)胞數(shù)目為10～25個(gè)視為中度炎癥(2分)、每個(gè)視野中炎癥細(xì)胞數(shù)目＞25個(gè)視為重度炎癥(3分)。

1.4.2 Western blot 提取肺組織總蛋白，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳、膜轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入MMP-9、TIMP-1、Western blot檢測蛋白水平的內(nèi)參(GAPDH)一抗，于4℃條件下孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入經(jīng)HRP標(biāo)記的二抗繼續(xù)孵育1 h，根據(jù)ECL試劑盒說明書對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯影、定影，觀察各組蛋白條帶成像情況，并進(jìn)行蛋白條帶分析。

1.4.3 RT-PCR 采用trizol法提取肺組織的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，參考RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)體系配比、擴(kuò)增體系設(shè)置，所用內(nèi)參基因及MMP-9、TIMP-1引物均有上海生工提供，以2-△△Ct計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件，計(jì)量資料以(±s)形式表示，若各組數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布且方差齊，采用單因素分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；若為非正態(tài)分布數(shù)據(jù)則采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)ɑ＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 格隆溴銨對(duì)大鼠肺組織的影響 取各組大鼠肺組織進(jìn)行病理組織學(xué)觀察，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組、干預(yù)組大鼠氣管周圍、血管周圍、肺間質(zhì)周圍炎癥情況評(píng)分均明顯升高(P＜0.05)；與模型組相比，干預(yù)組大鼠氣管周圍、血管周圍、肺間質(zhì)周圍炎癥情況評(píng)分均明顯降低(P＜0.05)；對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)整齊且無融合現(xiàn)象，無炎性細(xì)胞浸潤，模型組大鼠的肺組織細(xì)胞有炎癥浸潤，出現(xiàn)肺泡融合現(xiàn)象，干預(yù)組大鼠肺組病理情況較模型組有緩解，見表1，見圖1。

圖1 格隆溴銨對(duì)大鼠肺組織的影響(×200)

表1 各組大鼠肺組織病理學(xué)情況比較(±s) 單位：分

表1 各組大鼠肺組織病理學(xué)情況比較(±s) 單位：分

注：與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05。

?組別 例數(shù) 氣管周圍 血管周圍 肺間質(zhì)周圍對(duì)照組 10 0.20±0.02 0.21±0.04 0.24±0.05模型組 10 2.36±0.24a 1.97±0.13a 1.92±0.17a干預(yù)組 10 1.52±0.22ab 1.20±0.19ab 1.10±0.16ab F值 334.286 427.710 371.439 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 格隆溴銨對(duì)大鼠BALF中TNF-α、KC、GSH水平的影響 各組大鼠BALF中的TNF-α、KC、GSH檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組、干預(yù)組大鼠BALF中的TNF-α、KC含量均明顯升高(P＜0.05)，而GSH水平明顯降低(P＜0.05)；與模型組相比，干預(yù)組大鼠BALF中的TNF-α、KC含量均明顯降低(P＜0.05)，而GSH水平明顯升高(P＜0.05)，見表2。

表2 格隆溴銨對(duì)大鼠BALF中TNF-α、KC、GSH水平的影響(±s)

表2 格隆溴銨對(duì)大鼠BALF中TNF-α、KC、GSH水平的影響(±s)

注：TNF-α＝腫瘤壞死因子-α，KC＝角質(zhì)形成細(xì)胞衍生趨化因子，GSH＝還原型谷胱甘肽；與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05。

?組別 例數(shù) TNF-α(pg/mL) KC(pg/mL) GSH(μg/mL)對(duì)照組 10 124.02±13.20 29.54±3.55 6.28±0.52模型組 10 329.51±26.44a 98.24±11.07a 2.46±0.23a干預(yù)組 10 167.33±13.37ab 53.18±6.22ab 4.97±0.41ab F值 334.599 210.225 230.043 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 格隆溴銨對(duì)大鼠BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響 對(duì)各組大鼠BALF液中細(xì)胞分類進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，模型組與干預(yù)組BALF液中的細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比均明顯升高(P＜0.05)，而淋巴細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比均明顯降低(P＜0.05)；與模型組相比，干預(yù)組BALF液中的細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比均明顯降低(P＜0.05)，而淋巴細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比均明顯升高(P＜0.05)，見表3。

表3 格隆溴銨對(duì)大鼠BALF有核細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響(±s)

表3 格隆溴銨對(duì)大鼠BALF有核細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響(±s)

注：與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05。

組別 例數(shù) 細(xì)胞總數(shù)(106/mL) 單核細(xì)胞(%) 中性粒細(xì)胞(%) 淋巴細(xì)胞(%)對(duì)照組 10 1.76±0.14 86.24±5.33 2.41±0.18 11.35±1.15模型組 10 5.34±0.43a 70.32±6.01a 23.25±2.04ab 6.43±0.58ab干預(yù)組 10 2.52±0.21ab 78.24±6.94ab 13.02±1.29ab 8.71±0.86ab F值 429.332 16.868 556.094 75.827 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001?

2.4 格隆溴銨對(duì)大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平的影響 取各組大鼠肺組織用于MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平檢測，Western blot檢測結(jié)果顯示模型組、干預(yù)組大鼠肺組織中MMP-9、TIMP-1蛋白水平均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，干預(yù)組大鼠肺組織中MMP-9、TIMP-1蛋白水平均明顯低于模型組(P＜0.05)；RT-PCR檢測結(jié)果顯示模型組、干預(yù)組大鼠肺組織中MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA水平均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，而干預(yù)組大鼠肺組織中MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA水平均明顯低于模型組(P＜0.05)，見表4，見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1蛋白水平凝膠成像結(jié)果

表4 格隆溴銨對(duì)大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平的影響(±s)

表4 格隆溴銨對(duì)大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平的影響(±s)

注：MMP-9＝基質(zhì)金屬蛋白酶9，TIMP-1＝基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1；與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05。

組別 例數(shù) MMP-9 TIMP-1 MMP-9 mRNA TIMP-1 mRNA對(duì)照組 10 0.34±0.06 0.26±0.05 1.02±0.05 1.06±0.04模型組 10 0.87±0.06a 0.96±0.06a 2.01±0.08a 1.89±0.05a干預(yù)組 10 0.52±0.05ab 0.49±0.06ab 1.42±0.06ab 1.29±0.06ab F值 224.639 393.711 595.280 715.455 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001?

3 討論

慢阻肺氣流受限并以進(jìn)行性的方式發(fā)展，吸入有害顆粒、吸煙是慢阻肺發(fā)病的重要因素。本研究通過LPS經(jīng)氣管注入以及煙熏暴露用于慢阻肺大鼠模型制備，其肺組織病理結(jié)果顯示慢阻肺大鼠存在氣道炎癥反應(yīng)，并且肺組織有損傷情況。慢阻肺主要治療藥物為支氣管擴(kuò)張劑，抗膽堿能藥物也具有擴(kuò)張支氣管作用。格隆溴銨為新研發(fā)長效抗膽堿能藥物，屬于長效季銨類毒蕈堿受體拮抗劑，其對(duì)人M3受體選擇性高于對(duì)人M2受體的選擇性。目前已有研究顯示格隆溴銨經(jīng)人口吸入后5 min能夠達(dá)到血漿濃度峰值，90%被肺組織吸收，剩余被胃腸吸收，慢阻肺患者使用1周后，其藥代動(dòng)力學(xué)保持穩(wěn)定[8]。慢阻肺確切病理機(jī)制尚未闡明，但炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激在慢阻肺進(jìn)展中具有重要作用[9]。慢阻肺氣道炎癥會(huì)刺激氣道上皮細(xì)胞分泌炎性因子，促進(jìn)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞聚集，加重氣道組織細(xì)胞損傷[10]。TNF-α能夠促進(jìn)氣道黏液細(xì)胞黏液基因表達(dá)、呼吸爆發(fā)，加重氣道損傷程度，還可以通過刺激機(jī)體支氣管上皮細(xì)胞分泌IL-8[11]。IL-8可以通過促進(jìn)T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞聚集活化參與炎癥反應(yīng)[12]。KC功能與人IL-8相似，能夠向呼吸道轉(zhuǎn)移、活化，加重氣道炎癥[13]。機(jī)體自由基的產(chǎn)生、消除在正常生理活動(dòng)下處于動(dòng)態(tài)平衡，GSH水平降低可使組織細(xì)胞易受氧化劑攻擊，其含量變化也顯示機(jī)體抗自由基能力[14]。本研究顯示格隆溴銨干預(yù)可以降低慢阻肺大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞所占百分比，升高淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞所占百分比。單淑香等[15]研究顯示噻托溴銨可以降低慢阻肺大鼠的中性粒細(xì)胞水平，本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相似，推測格隆溴銨對(duì)慢阻肺大鼠肺組織炎癥的改善作用，可能是通過調(diào)整慢阻肺大鼠肺組織中白細(xì)胞分類比例，影響炎性因子釋放，從而調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)。

MMPs含量升高可以引起氣道外細(xì)胞外基質(zhì)破壞，引起氣道重塑。慢阻肺促進(jìn)巨噬細(xì)胞聚集、炎性因子分泌，刺激機(jī)體產(chǎn)生過多MMP-9，基質(zhì)發(fā)生降解，影響氣道重塑。TIMP-1具有促進(jìn)平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞增生，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞間質(zhì)、肌層增厚。正常生理狀態(tài)下MMP-9在肺組織呈微量表達(dá)，當(dāng)受到刺激因素作用時(shí)，支氣管上皮細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞均能產(chǎn)生MMP-9，促進(jìn)氣道重塑[16-17]。本研究結(jié)果顯示格隆溴銨可以降低慢阻肺大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1蛋白及基因表達(dá)量。張鵬飛等[18]研究顯示銀杏葉提取物可以通過降低MMP-9、TIMP-1蛋白水平，從而預(yù)防、減少慢阻肺大鼠肺組織重塑與纖維化。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相似，推測格隆溴銨對(duì)慢阻肺大鼠肺組織的重塑有抑制作用，可能通過降低慢阻肺大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，格隆溴銨對(duì)慢阻肺大鼠的氣道炎癥有一定的改善作用，可能與調(diào)節(jié)炎性因子水平有關(guān)；還可以通過調(diào)節(jié)大鼠肺組織中的MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平影響肺組織的重塑，實(shí)現(xiàn)對(duì)慢阻肺大鼠的肺組織保護(hù)作用。