唐 川，陳和強(qiáng)

(甘孜州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 康定 626000)

0 引言

布魯菌病(brucellosis)是一種由布魯氏桿菌引起的多種動(dòng)物的慢性傳染病，也可以感染人，又稱布魯氏桿菌病。在家畜中牛、羊、豬易感。主要表現(xiàn)為動(dòng)物流產(chǎn)、死胎、不孕，引起子宮、胎盤、睪丸發(fā)炎等病理變化，不僅危害畜牧產(chǎn)業(yè)的發(fā)展而且威脅著人類健康。屬于我國(guó)二類動(dòng)物疫病，該病最主要的傳染源是感染的妊娠母畜，其流產(chǎn)時(shí)排出的陰道分泌物、胎衣和胎兒中都帶有大量細(xì)菌。幼齡動(dòng)物對(duì)布魯氏菌不易感，性成熟后對(duì)該該病的易感性增高。流產(chǎn)主要發(fā)生在初次妊娠的動(dòng)物身上，患病動(dòng)物往往只發(fā)生一次流產(chǎn)，再次流產(chǎn)的少見。本病主要通過消化道傳播，其他的傳播途徑有呼吸道，皮膚等。布魯氏菌病的流行常常是由于飼養(yǎng)管理不良、營(yíng)養(yǎng)不足、潮濕及養(yǎng)殖密度過大等原因造成。人類多數(shù)為職業(yè)感染，獸醫(yī)、飼養(yǎng)管理人員、屠宰場(chǎng)及動(dòng)物加工廠工人在接觸流產(chǎn)動(dòng)物時(shí)易發(fā)生感染。人感染后體溫異常，波浪熱或長(zhǎng)期低熱，關(guān)節(jié)肌肉疼痛，睪丸炎附睪炎，流產(chǎn)及生殖障礙。因此本病不僅阻礙了畜牧業(yè)的發(fā)展，而且嚴(yán)重威脅著公共生物安全。

在四川省，布魯氏桿菌病是重點(diǎn)防控的主要人獸共患疾病，四川省動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心考察研討四川省布魯氏菌病的流行狀況和防治效果發(fā)現(xiàn)，該病在20世紀(jì)末通過采取以免疫為主，免、檢、殺、滅的綜合防治措施使疫情得到有效控制，然而近年來布魯氏菌病的流行有回升的趨勢(shì)。2013年國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃，鼓勵(lì)有條件的省份開展布病感染情況調(diào)查，分析疾病的流行情況，以便制定合理的疾病防控計(jì)劃。在稻城縣，牦牛養(yǎng)殖是當(dāng)?shù)厝嗣竦闹匾?jīng)濟(jì)支柱，但由于該地區(qū)環(huán)境復(fù)雜，養(yǎng)殖粗放和獸醫(yī)技術(shù)落后，布病的檢測(cè)存在較大難度，四川省甘孜州稻城縣牦牛布病的感染狀況還未見完整的報(bào)道。

布魯氏菌病的確診須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查，診斷和檢疫布病的最常用方法是凝集試驗(yàn)，其優(yōu)點(diǎn)是特異強(qiáng)和敏感高。我國(guó)最常用的檢測(cè)試驗(yàn)為虎紅平板試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)，其中虎紅平板試驗(yàn)是OIE確定的國(guó)際貿(mào)易指定試驗(yàn)，本研究通過用虎紅平板試驗(yàn)初篩，陽性和可疑者用試管凝集試驗(yàn)復(fù)核方法對(duì)稻城縣牦牛布病抗體進(jìn)行檢測(cè)與分析，從而為稻城縣牦牛布病的防治提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)場(chǎng)地

甘孜州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 被檢血清

2018年由稻城縣農(nóng)牧科技供銷合作局，在稻城縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的牧戶中采集并分離牦牛血清，共采集200份。

1.2.2 主要試劑

商品化的布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原、布魯氏菌病凝集抗原、陰性血清、陽性血清、苯酚(石炭酸)、0.9%生理鹽水。

1.3 方法

首先對(duì)牦牛血清用虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行初次檢驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果為陽性和可疑血清用試管凝集試驗(yàn)再次檢驗(yàn)，試管凝集試驗(yàn)陽性即為布魯氏桿菌病感染。

1.3.1 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)生物安全防護(hù)

實(shí)驗(yàn)人員開始實(shí)驗(yàn)前，脫掉外衣及鞋子，穿戴好實(shí)驗(yàn)服、防護(hù)服、一次性口罩及帽子。實(shí)驗(yàn)前后都要對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行全面消毒滅菌，進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)時(shí)選用一次性專業(yè)檢測(cè)紙板，進(jìn)行試管凝集試驗(yàn)時(shí)選用一次性試管，使用后直接廢棄以減少污染。試驗(yàn)結(jié)束后，將使用過的一次性試驗(yàn)用品和防護(hù)用品，消毒后焚燒或無害化處理。工作人員脫掉防護(hù)用品后，用0.5%新潔爾滅浸泡雙手，再用肥皂水沖洗。在更衣室脫下實(shí)驗(yàn)服并用紫外光照射消毒。

1.3.2 虎紅平板試驗(yàn)

按照《中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)布氏桿菌平板凝集試驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行。

1)將受檢血清、布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清和抗原從冰箱取出平衡至室溫，渦旋混勻血清和抗原，吸取30 μL的被檢血清在玻璃板4 cm2方格內(nèi)的一側(cè)，再吸取虎紅平板凝集抗原加于玻璃板方格的另一側(cè)。

2)用滅菌的移液器吸頭快速攪拌混合抗原和血清，混勻成直徑約2 cm的圓形。反應(yīng)4 min后可觀察結(jié)果。

3)同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和陽性血清對(duì)照。

結(jié)果判定:在標(biāo)準(zhǔn)陰性血清不出現(xiàn)凝集、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清出現(xiàn)凝集時(shí)，試驗(yàn)成立，待測(cè)血清在4 min后若出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象則認(rèn)為是陽性，不出現(xiàn)凝集認(rèn)為是陰性。

1.3.3 試管凝集試驗(yàn)

1)試驗(yàn)開始前先將待測(cè)血清、抗原液等取出冰箱，放置于室溫條件下，待其恢復(fù)到室溫后開始試驗(yàn)，試驗(yàn)應(yīng)在18℃～25℃條件下進(jìn)行。

2)使用前應(yīng)當(dāng)混勻試劑。

3)稀釋液。0.5%苯酚(石炭酸)生理鹽水：將5 mL苯酚加入1 000 mL生理鹽水中；配制0.9% 生理鹽水：稱取NaCl，9 g定容到1 000 mL。

4)稀釋抗原液：用配置好的稀釋液來稀釋布魯氏菌病凝集抗原，稀釋的比例為1：10。

5)準(zhǔn)備3只試驗(yàn)管，1只試管中加入2.4 mL生理鹽水，另2只試管各加入0.5 mL生理鹽水。

6)取待測(cè)血清0.1 mL加入2.4 mL生理鹽水內(nèi)，混勻后取0.5 mL加入第2試管做倍比稀釋，混合后取0.5 mL加入第3試管做倍比稀釋，第1管應(yīng)當(dāng)棄去1.5 mL剩余0.5 mL稀釋血清，最后一管棄去0.5 mL剩余0.5 mL稀釋血清。

7)將0.5 mL稀釋抗原液分別加入上述不同稀釋倍數(shù)的血清中，各管內(nèi)待檢血清分別稀釋為1：25、1：50、1：100。

8)陰陽對(duì)照試驗(yàn)管制備：將陰陽對(duì)照血清按要求體積稀釋后，操作步驟參照5)、6)、7)。

9)比濁管制備：將已稀釋好的工作抗原用等量稀釋液作對(duì)倍稀釋，然后按表1配制比濁管。

表1 試管凝集試驗(yàn)參照比濁管的配置

10)孵育：將試驗(yàn)管，對(duì)照管及比濁管充分振蕩后置37℃±l℃溫箱中孵育20～22 h，取出室溫靜置2 h，不需搖晃，以比濁管為標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

結(jié)果判定：待檢血清效價(jià)在1:100(++)及以上者為陽性。

2 結(jié)果

稻城縣牦牛血清布病檢測(cè)共200份，總陽性率為3%。其中3個(gè)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的牦牛血清樣本有2個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)檢測(cè)出陽性樣品，赤土鄉(xiāng)檢測(cè)出5個(gè)陽性樣品，陽性率3.55%；傍河鄉(xiāng)1個(gè)陽性樣品，陽性率3.57%；香格里拉鄉(xiāng)0個(gè)陽性樣本，陽性率0%。血清檢測(cè)結(jié)果如表2所示，虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，試管凝集試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

表2 稻城縣牦牛布病抗體檢測(cè)結(jié)果

圖1 虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果

圖2 試管凝集試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

基于對(duì)稻城縣牦牛布病抗體進(jìn)行檢測(cè)與分析，發(fā)現(xiàn)稻城縣部分地區(qū)牦牛存在布魯氏菌的感染。為了有效控制稻城縣牦牛布魯氏病的流行，有關(guān)部門應(yīng)當(dāng)引起高度重視，出臺(tái)相應(yīng)的防治政策。

4 討論

4.1 稻城縣牦牛布病感染情況分析

布魯氏菌病是導(dǎo)致牦牛繁殖障礙的重要原因，往往給牦牛養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)作為人獸共患病，也嚴(yán)重危害著公共衛(wèi)生安全。牦牛布病感染各地均有報(bào)道，林元青[1]等2015年檢測(cè)采集于青海省不同地區(qū)的牦牛血清樣本，結(jié)果顯示陽性率高達(dá)39.29%；黎能金[2]等2008年對(duì)四川阿壩州牦牛檢測(cè)表明，布病的感染率為5%；余朝彥[3]等2012年對(duì)四川阿壩地區(qū)牛檢測(cè)表明，布病的陽性率為5.23%。通過檢測(cè)稻城縣牦牛血清布病陽性率發(fā)現(xiàn)，稻城縣存在布魯氏菌的感染，病畜長(zhǎng)期帶菌排菌，牦牛在混飼的情況下極易造成傳染。為有效控制稻城縣牦牛布魯氏病的流行，有關(guān)部門應(yīng)當(dāng)高度重視，出臺(tái)相應(yīng)的防治政策。

4.2 出現(xiàn)布病疫情的原因

4.2.1 傳染源沒有徹底清除

該地區(qū)牦牛出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀后，經(jīng)診斷檢疫確診為布魯氏菌病，由于病畜撲殺經(jīng)費(fèi)有限，對(duì)陽性畜處理不徹底，雖采取了陽性畜隔離，對(duì)其圈舍進(jìn)行消毒等措施處理，但措施不嚴(yán)密，使其成為新的傳染源，導(dǎo)致更多的牲畜感染。

4.2.2 外源疫病的傳入

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，自繁自養(yǎng)已滿足不了養(yǎng)殖戶的生產(chǎn)需求，外引動(dòng)物成為必然趨勢(shì)，外引動(dòng)物沒經(jīng)過嚴(yán)格檢疫就混群飼養(yǎng)，導(dǎo)致更多的牲畜出現(xiàn)感染[4]。

4.2.3 飼養(yǎng)者飼養(yǎng)管理水平參差不齊

調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，稻城縣布魯氏菌病陽性病例主要集中出現(xiàn)在個(gè)別畜主飼養(yǎng)的牦牛群中，這表明牦牛布魯氏菌病的感染與飼養(yǎng)管理情況密切相關(guān)。有的畜主給牦牛飼喂受污染的飼料或飼料營(yíng)養(yǎng)不均衡，導(dǎo)致牦牛群免疫力下降，更易受到布魯氏菌病的感染。此外環(huán)境的衛(wèi)生也是重要環(huán)節(jié)，未做到定期消毒，發(fā)生疫情后未徹底消毒也會(huì)導(dǎo)致布病的感染[5]。

4.3 措施與建議

未發(fā)病地區(qū)注意飼料衛(wèi)生，保證飼料合理的營(yíng)養(yǎng)配比，搞好環(huán)境衛(wèi)生，定期消毒。堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，如需引種須經(jīng)過免疫學(xué)檢查，確保健康無病方可混群。發(fā)病地區(qū)，通過全群檢疫，淘汰陽性動(dòng)物，來凈化畜群。通過人工授精，產(chǎn)仔后立即隔離，產(chǎn)房消毒等方法繁殖健康幼畜。同時(shí)對(duì)污染的環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格消毒?？刂迫藛T流動(dòng)，設(shè)立消毒通道，人員、車輛消毒后方可進(jìn)出養(yǎng)殖場(chǎng)。

做好免疫接種工作，布魯氏桿菌是兼性胞內(nèi)寄生菌，對(duì)化學(xué)藥物抵抗力較強(qiáng)，免疫接種是控制本病的有效措施。可采用牛流產(chǎn)布魯氏菌19號(hào)苗對(duì)易感畜群進(jìn)行免疫接種，采取連續(xù)3年免疫、第4年停免、第5年最后一次免疫的防控程序。接種防疫期間，注意做好血清抗體監(jiān)測(cè)，陽性保護(hù)率在80%以上，才能達(dá)到保護(hù)的最終目的[6]。

人布病的預(yù)防要注意職業(yè)感染，加強(qiáng)宣傳教育，養(yǎng)殖場(chǎng)工人、獸醫(yī)、屠宰場(chǎng)及動(dòng)物加工廠人員在接觸患病動(dòng)物和陽性動(dòng)物時(shí)要注意防護(hù)，特別是在產(chǎn)仔季節(jié)。相關(guān)人員定期體檢，疑似布魯氏菌病的要及時(shí)診斷，及時(shí)治療，避免轉(zhuǎn)變?yōu)槁訹7]。