許國(guó)洋，付文貴，徐登峰，周 雪通信作者

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2.重慶市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，重慶 榮昌 402460)

0 引言

禽白血病(Avian Leukosis)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科，甲型反轉(zhuǎn)錄病毒屬的禽白血病、肉瘤病毒群中的病毒引起的禽類(lèi)多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱(chēng)，可感染所有種禽群和商品雞群[1-2]。該病毒為反轉(zhuǎn)錄病毒科，病毒粒子呈20面體對(duì)稱(chēng)，有囊膜，病毒抵抗力較差，對(duì)高溫、強(qiáng)堿和強(qiáng)酸較為敏感。依據(jù)禽白血病病毒的宿主范圍和抗原性可將其分為多個(gè)亞型，其中，雞外源性禽白血病病毒主要包括A、B、C、D和J亞群，以及內(nèi)源性的E亞群[3]。雞群感染禽白血病后，易出現(xiàn)免疫力下降、腫瘤性疾病、產(chǎn)蛋率降低等癥狀，嚴(yán)重者引起死亡，對(duì)家禽業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重威脅[4-5]。該病尚無(wú)有效疫苗和特效藥物，主要防控措施是加強(qiáng)疫病監(jiān)測(cè)，淘汰陽(yáng)性病例，切斷垂直傳播途徑，優(yōu)化種用雞群，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。目前，重慶地區(qū)偶有禽白血病的發(fā)生，基于此，針對(duì)重慶武隆某養(yǎng)雞場(chǎng)開(kāi)展種用雞群的禽白血病檢測(cè)，為該場(chǎng)疫病防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

武隆區(qū)某種雞場(chǎng)雞群，包括武隆黑雞、大寧河雞、青腳麻雞、石柱土雞、鳳羽雞、羅曼粉+麻雞雜交6個(gè)品種，6～7月齡。

1.2 主要試劑和儀器

DF-1細(xì)胞，由重慶市畜牧科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；IDEXX禽白血病p27抗原檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司；CO2培養(yǎng)箱，購(gòu)自艾利特生物科學(xué)(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本的處理

泄殖腔拭子：采樣前在樣本管中加入1 mL樣本稀釋液，專(zhuān)用無(wú)菌棉簽采集種雞泄殖分泌物，置于樣本管后-80℃保存?zhèn)溆?。蛋清：收集種用母雞新鮮雞蛋，75%酒精棉球消毒雞蛋和打孔器，打孔器在雞殼上鉆小孔，5 mL注射器吸取約1 mL蛋清至無(wú)菌樣本管中，-80℃保存?zhèn)溆谩＞海翰杉u精液50 μL于1.5 mL離心管中，離心管中含150 μL滅菌的PBS溶液，混勻后，反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心10 min，取上清接種于DF-1細(xì)胞中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7 d，反復(fù)凍融3次，收集上清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 不同樣本的禽白血病抗原檢測(cè)分析

隨機(jī)選取100只母雞和100只公雞，采集2次泄殖腔拭子、雞蛋和精液樣本，時(shí)間間隔1 d。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，吸取不同樣本100 μL，加入到ELISA反應(yīng)板中，并分別加入陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照100 μL各2孔，蓋好反應(yīng)板，在25℃條件下孵育60 min；350 μL蒸餾水洗板3次，最后一次洗板后將液體拍干；每孔加入100μL酶標(biāo)抗體，在25℃條件下孵育60 min；重復(fù)洗板操作；每孔加入100 μL TMB底物，蓋好板在25℃條件下避光孵育15 min后，每孔加入100 μL終止液終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀測(cè)定650 nm吸光值，通過(guò)計(jì)算檢測(cè)樣本與陽(yáng)對(duì)照比值(S/P)進(jìn)行樣本的陰、陽(yáng)性判定。S/P>0.2判定為陽(yáng)性，S/P≤0.2判定為陰性。同時(shí)，對(duì)比分析不同樣本檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性。

1.3.3 不同品種的的禽白血病抗原檢測(cè)分析

依據(jù)不同樣本的檢測(cè)結(jié)果，選用合理的樣本采集方式，針對(duì)該雞場(chǎng)不同品種種用雞群進(jìn)行抗原檢測(cè)，檢測(cè)方法參照1.3.2，并對(duì)不同品種的禽白血病感染情況進(jìn)行對(duì)比分析。

2 結(jié)果

2.1 公、母雞不同樣本ALV-p27抗原檢測(cè)結(jié)果

ELISA檢測(cè)100份雞群泄殖腔拭子，23份樣本為陽(yáng)性，陽(yáng)性率23%。對(duì)應(yīng)的蛋清樣本中，25份為陽(yáng)性，陽(yáng)性率25%。結(jié)果顯示，蛋清ALV-p27抗原陽(yáng)性檢出率高于泄殖腔拭子。而公雞的精液陽(yáng)性率(26%)高于泄殖腔拭子的陽(yáng)性率(24%)，如表1所示。

表1 不同樣本ALV-p27抗原檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同樣本檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性分析

對(duì)各樣本檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性分析，發(fā)現(xiàn)母雞泄殖腔試子和蛋清樣本的重復(fù)率差別較小，分別為95%和96%；公雞的泄殖腔試子和精液樣本的重復(fù)率分別為96%和100%，精液的重復(fù)性高于泄殖腔試子，結(jié)果如圖1所示。

圖1 種雞各樣本檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性分析

2.3 不同品種的種雞禽白血病ALV-p27抗原檢測(cè)結(jié)果

基于各樣本檢測(cè)結(jié)果和樣本處理的復(fù)雜程度，對(duì)于種群較大的雞群選擇泄殖腔拭子作為樣本進(jìn)行ELISA檢測(cè)，共計(jì)檢測(cè)母雞2 322只，ALV-p27抗原陽(yáng)性數(shù)量392只，陽(yáng)性率16.88%。公雞429只，p27抗原陽(yáng)性數(shù)量129只，陽(yáng)性率30.07%。不同品種種雞ALV-p27抗原陽(yáng)性率明顯差異較大如表2、表3所示。

表2 不同品種母雞泄殖腔拭子ALV-p27抗原結(jié)果

表3 不同品種公雞群泄殖腔拭子ALV-p27抗原結(jié)果

3 討論

通過(guò)對(duì)該雞場(chǎng)禽白血病進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該場(chǎng)存在禽白血病陽(yáng)性病例，通過(guò)對(duì)種用雞群不同樣本的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)泄殖腔試子、蛋清和精液均可獲得較好的檢測(cè)結(jié)果，其中，精液的檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性高于泄殖腔試子，但綜合考慮檢測(cè)時(shí)效性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性，泄殖腔拭子更適合種群的大規(guī)模檢測(cè)，而蛋清和精液更適合少量樣本的檢測(cè)。此外，該種群中，青腳麻雞的禽白血病檢出率均遠(yuǎn)低于其他品種，其中母雞陽(yáng)性檢出率為2.23%，公雞為9.80%，該場(chǎng)地可加大青腳麻雞的飼養(yǎng)量。結(jié)合其養(yǎng)殖品種、飼養(yǎng)模式和養(yǎng)殖規(guī)模，建議擴(kuò)大檢測(cè)規(guī)模，對(duì)各階段雞群進(jìn)行抽樣檢測(cè)，及時(shí)淘汰陽(yáng)性病例，重點(diǎn)對(duì)種雞子代雞群進(jìn)行抗原檢測(cè)，切斷垂直傳播途徑，同時(shí)，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，對(duì)糞污及時(shí)處理，防止水平傳播[6]。