汪 鵬 陰芳華 韓睿杭 張 旭 沈福海

華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 河北唐山 063210

我國鋼鐵產(chǎn)能居世界第一，從業(yè)人員眾多，但其工作環(huán)境惡劣，勞動強度大，是職業(yè)病的高發(fā)人群，鐵礦從業(yè)者人年死亡率為891.15/105，52年累計死亡率為48.32%，死亡風(fēng)險為普通人群的1.49倍，明顯高于全國城鎮(zhèn)居民平均水平[1]，鐵礦粉塵對工人的危害也普遍受到國內(nèi)外的重視。關(guān)于鐵礦粉塵等可吸入顆粒物對生物體損傷的研究多以呼吸系統(tǒng)為主，而對于生殖系統(tǒng)及遺傳物質(zhì)的研究較少。本文通過建立小鼠吸入鐵礦粉塵模型，觀察鐵礦粉塵對其生殖系統(tǒng)的影響，并探討其是否具有致癌及致基因突變的危險，報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料及試劑 鐵礦粉塵來源于河北省曹妃甸礦石碼頭附近某企業(yè)采集的沉降塵。經(jīng)ICP分析檢測，樣品中各金屬元素的含量如下：Fe 2.8×108μg/kg、Al 1.45×107μg/kg、Mg 1.33×106μg/kg、Mn 9.98×105μg/kg、 Cu 7.69×104μg/kg、Pb 5.10×104μg/kg。用焦磷酸法測得游離二氧化硅含量為13.42%。酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒為欣博盛生物科技有限公司出品。

1.2實驗動物及分組 本實驗采用7周齡C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～22g，由華北理工大學(xué)實驗動物中心提供，動物證號[SCKK(2014-0008)]。在清潔、通風(fēng)環(huán)境中飼養(yǎng)，保證適宜的純凈水和食物，實驗開始前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。根據(jù)染塵量將小鼠分為4組，對照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組，每組18只，雌雄各半。本實驗經(jīng)華北理工大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3實驗方法及檢測指標(biāo)

1.3.1實驗動物染塵 采用非氣管暴露滴注法染塵。低濃度組小鼠染塵量為6.5μg/g，中濃度組26.5μg/g，高濃度組107μg/g，對照組滴注不含粉塵的生理鹽水。分別于染塵后7d(短期效應(yīng)實驗)和112d(長期效應(yīng)實驗)采集檢測標(biāo)本。

1.3.2組織病理檢測 取各組小鼠睪丸、卵巢組織，迅速放入10%甲醛溶液中固定、脫水，石蠟包埋、切片。然后伊紅(HE)染色，用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.3.3微核實驗檢測 取各組小鼠胸骨骨髓，涂于有小牛血清的載玻片上，固定保存，經(jīng)吉姆薩(Giemsa)染色，用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.3.4精子畸形實驗檢測 取雄性小鼠附睪組織，在生理鹽水中剪碎、涂片，用甲醇固定，HE染色，用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.3.5彗星實驗檢測 取小鼠血液滴在瓊脂糖凝膠的載玻片上，電泳，溴化乙錠(EB)染色。用熒光顯微鏡觀察。

1.3.6ELISA檢測 根據(jù)使用的試劑盒內(nèi)說明書操作。

2 結(jié)果

2.1小鼠生殖系統(tǒng)病理學(xué)檢測結(jié)果

2.1.1各組小鼠睪丸組織病理改變 短期效應(yīng)實驗中，HE染色結(jié)果顯示各組小鼠睪丸細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞間未見明顯炎性細(xì)胞、滲出液及出血。在長期效應(yīng)實驗中，各組均無明顯病理變化。見圖1、圖2。

圖1 短期效應(yīng)實驗各組小鼠睪丸病理切片 標(biāo)尺25μm 400×

2.1.2各組精子畸形實驗 短期效應(yīng)實驗和長期效應(yīng)實驗中，各組小鼠精子畸變率均無明顯差異，說明廠區(qū)鐵礦粉塵濃度升高到16倍時不會對小鼠精子成熟過程產(chǎn)生明顯的影響。見表1、表2。

2.1.3各組小鼠卵巢組織病理變化 在短期效應(yīng)實驗中，各組小鼠卵巢細(xì)胞HE染色結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞間未見明顯炎性細(xì)胞、滲出液及出血。在長期效應(yīng)實驗中各組也無明顯病理變化。見圖3、圖4。

圖3 短期效應(yīng)實驗各組小鼠卵巢病理切片 標(biāo)尺25μm，400×

圖4 長期效應(yīng)實驗各組小鼠卵巢病理切片 標(biāo)尺25μm，400×

2.2各組小鼠血清中腫瘤壞死因子(TNF-α)水平比較 在短期效應(yīng)實驗中，與對照組比較，低濃度組血清TNF-α水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)；中濃度組比低濃度組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；高濃度組TNF-α水平最高，與其余各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；小鼠血清TNF-α水平呈現(xiàn)出隨染塵量增加而升高的趨勢。在長期效應(yīng)實驗中，各組小鼠血清TNF-α水平呈現(xiàn)出隨染塵量增加而降低的趨勢：低濃度組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，中、高濃度組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 各種小鼠血清TNF-α含量比較

2.3小鼠微核實驗 在短期和長期效應(yīng)實驗中，各染塵組小鼠外周血淋巴細(xì)胞中出現(xiàn)微核，但均未超過異常上限(4‰)。見表3、表4。

表3 各組小鼠短期效應(yīng)實驗中微核實驗結(jié)果

表4 各組小鼠長期效應(yīng)實驗中微核實驗結(jié)果

2.4小鼠彗星實驗 在短期和長期效應(yīng)實驗中均未發(fā)現(xiàn)染毒小鼠淋巴細(xì)胞彗星實驗拖尾率增高的情況。說明鐵礦粉塵濃度升高4～16倍，不會造成淋巴細(xì)胞的遺傳物質(zhì)損傷。見表5、表6。

表5 各組小鼠短期效應(yīng)實驗中彗星實驗結(jié)果

表6 各組小鼠長期效應(yīng)實驗中彗星實驗結(jié)果

3 討論

鐵礦粉塵主要包括鐵、硅、鋁、鈷、錳、鈦及微量的砷、鎘等元素。經(jīng)破碎、磁選、燒結(jié)后各元素含量有一定改變，但不會消除。鈷、銅、錳、鋁和鐵等經(jīng)氧化還原反應(yīng)的金屬離子對脂質(zhì)過氧化都有促發(fā)作用。鐵離子在生物組織中含量較高，故在生物體內(nèi)的作用最強，此外一些鐵的鰲合物，如血紅蛋白復(fù)合物對體內(nèi)外的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)都具有促發(fā)作用[2]。粉塵是空氣中的主要污染物，Deng等[3]在對暴露于大氣污染物與精子質(zhì)量的研究中發(fā)現(xiàn)，盡管高暴露組與低暴露組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但總體趨勢顯示長期暴露于高水平的環(huán)境污染物可能會改變精子質(zhì)量。對于PM2.5，普遍認(rèn)為是附著在可吸入顆粒物上的化學(xué)致癌物，有可能導(dǎo)致肺癌，但無法排除顆粒物本身獨立于已知致癌物而引發(fā)肺癌的可能[4]。鐵礦粉塵中鐵的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他元素，一些有害元素如錳和鉛的含量非常低，可以忽略不計。一般認(rèn)為鐵元素作為機體日常所必需的一種微量元素，參與機體的新陳代謝，會消除對身體的負(fù)面影響。大氣中PM2.5上附著多種重金屬和有機物，有研究發(fā)現(xiàn)暴露于PM2.5 16周后小鼠精子密度顯著下降并引起睪丸DNA損傷和組織病理學(xué)改變，最終導(dǎo)致不育；擾亂雌激素分泌，導(dǎo)致卵巢內(nèi)卵泡的儲備降低[5-6]。本次短期效應(yīng)實驗和長期效應(yīng)實驗結(jié)果均顯示，在本研究的染塵量下，實驗小鼠睪丸及卵巢組織結(jié)構(gòu)清晰完整，未見炎癥反應(yīng)，說明鐵礦粉塵不會被轉(zhuǎn)移至睪丸及卵巢組織中，不會對實驗動物的睪丸組織、卵巢組織造成危害。本次實驗結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果不一致，究其原因可能是PM2.5含有多種重金屬及有機物，成分更為復(fù)雜，導(dǎo)致其毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鐵礦粉塵，從而會對小鼠的生殖系統(tǒng)造成損傷。朱靜[7]發(fā)現(xiàn)褪黑素可改善氯化鎘導(dǎo)致的卵巢組織結(jié)構(gòu)異常及排卵障礙，是一種有效的干預(yù)手段。另外本實驗通過對小鼠精子畸形、淋巴細(xì)胞微核、彗星實驗進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示各指標(biāo)所產(chǎn)生的異常均在正常值范圍內(nèi)，并未發(fā)現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)現(xiàn)象，說明在現(xiàn)有粉塵濃度下，鐵礦粉塵不會對小鼠的遺傳物質(zhì)造成損傷。

非遺傳毒性致癌物的重要致癌機制之一是氧化應(yīng)激[8]。TNF-α是直接殺傷腫瘤作用最強的生物分子之一。目前已知其對腫瘤細(xì)胞P388、K562、S180的DNA合成有不同的抑制作用。另外，對部分小鼠的移植瘤有抑制作用，并可以使小鼠壽命延長[9]。有研究表明，TNF-α在不同的牛卵泡期均有表達(dá)，而在培養(yǎng)中添加TNF-α后會降低卵泡存活率，增加卵巢組織中凋亡細(xì)胞的數(shù)量[10]。本次研究在短期效應(yīng)實驗中各濃度組小鼠血清中TNF-α水平差異很大；長期效應(yīng)實驗中各組差異變小，逐漸趨于平穩(wěn)。短期及長期效應(yīng)實驗中均未見卵巢組織發(fā)生病理改變，卵泡發(fā)育正常，提示小鼠體內(nèi)并沒有發(fā)生癌變，只是在剛吸入鐵礦粉塵時引起肺部炎癥反應(yīng)導(dǎo)致血清中TNF-α的含量發(fā)生變化。鐵礦粉塵在現(xiàn)有粉塵濃度下并不具有致癌性，也在一定程度上證明鐵及可吸入顆粒物本身沒有獨立于已知致癌物引發(fā)癌變的能力。

綜上所述，本次研究結(jié)果未見通過呼吸道進(jìn)入機體的鐵礦粉塵對小鼠生殖系統(tǒng)及遺傳物質(zhì)造成損傷，也未見其具有致癌和致突變性質(zhì)?？梢栽诤罄m(xù)實驗中驗證TNF-α是否會對小鼠卵泡造成影響。