張敏 周曉晴 李保華 羅超 唐僑

胃癌是發(fā)病率和病死率均較高的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)生機制比較復(fù)雜，遺傳因素、環(huán)境飲食因素、幽門螺桿菌感染等癌前病變以及吸煙等不良生活習(xí)慣均是胃癌發(fā)生的誘因[1]。目前臨床上常采用內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)(endoscopic submu-cosal dissection，ESD)治療早期胃癌，該治療方法是一種微創(chuàng)術(shù)，具有術(shù)后恢復(fù)快以及臨床效果較佳等優(yōu)勢，但研究顯示仍有部分患者會發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)[2]。近來很多研究證實人體內(nèi)多種基因均參與了胃癌發(fā)生發(fā)展歷程，有學(xué)者們報道DLC-1蛋白對于癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移具有明顯抑制作用[3]。編碼原鈣黏蛋白10(protocadherin-10，PCDH10)作為多種惡性腫瘤的預(yù)測標(biāo)志物之一，該基因甲基化過程與胃癌進(jìn)程存在緊密聯(lián)系，且PCDH10甲基化水平與腫瘤不良預(yù)后具有顯著相關(guān)性。但目前臨床上尚未完全揭示DLC-1和PCDH10表達(dá)水平對于胃癌患者預(yù)后的影響作用[4]。NQO1作為腫瘤易感基因，該基因突變會增加胃癌發(fā)生風(fēng)險；而吸煙作為多種腫瘤的獨立危險因素已被證實，有研究報道吸煙與NQO1多態(tài)性存在交互作用，二者會共同促進(jìn)誘導(dǎo)胃癌發(fā)生和進(jìn)展[5]。本文將探討DLC-1、PCDH10表達(dá)水平和NQO1基因多態(tài)性與吸煙誘導(dǎo)胃癌ESD術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，旨在為胃癌復(fù)發(fā)預(yù)防和控制提供參考價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性的選取2015年1月至2018年1月在四川省儀隴縣人民醫(yī)院進(jìn)行ESD術(shù)的202例胃癌患者作為研究對象，其中男128例(63.37%)，女74例(36.63%)；年齡38～78歲，平均年齡(58.69±6.87)歲。根據(jù)患者患胃癌前是否吸煙分為吸煙組(n=102)和不吸煙組(n=100)。吸煙的定義標(biāo)準(zhǔn)為：每天吸煙1支及以上，吸煙時間持續(xù)半年以上。102例吸煙患者每天的人均吸煙量為(5.65±1.02)支，吸煙時間為8個月～10年，平均吸煙時間為(5.36±0.53)年。2組患者年齡、性別比、腫瘤病理學(xué)分型等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。根據(jù)患者行胃癌ESD術(shù)后1年內(nèi)的復(fù)發(fā)情況分為復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組(術(shù)后每3個月對患者隨訪1次，隨訪時間為1年，終點事件包括復(fù)發(fā)或死亡)。所有患者簽署知情同意書，本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)[6]：①患者均經(jīng)病理切片確診為胃癌，且滿足ESD術(shù)治療適應(yīng)癥并進(jìn)行ESD術(shù)治療者；②未接受放化療或靶向治療者；③自愿并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心腎功能不全、重度高血壓等嚴(yán)重疾病者；②患有嚴(yán)重內(nèi)外科疾病或傳染病者；③既往接受過胃癌切除術(shù)或放療、化療者；④患有嚴(yán)重精神疾病者；⑤無法接受或完成隨訪者。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料收集:全面收集所有研究對象的臨床資料，包括性別、年齡、病理類型以及臨床分期等資料。

1.3.2 DLC-1蛋白表達(dá)檢測:采用SP法檢測胃癌和癌旁組織以及正常胃組織的DLC-1表達(dá)：使用抗體及試劑盒為濃縮型DLC-1兔抗人單克隆抗體(購自GENE TEX)和DAB顯色試劑盒和SP試劑盒(購自默沙克生物)，將ESD手術(shù)過程中，于胃竇部位采集患者胃癌組織(距腫瘤中心<1 cm)、癌旁組織(距腫瘤中心<3 cm的邊緣)以及正常胃組織(距離腫瘤中心>5 cm)，石蠟包埋后制備成厚度為2 μm切片，然后使用枸櫞酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)經(jīng)過微波處理后修復(fù)抗原，于室溫下孵育DLC-1抗體30 min。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：DLC-1免疫反應(yīng)主要發(fā)生在胞質(zhì)內(nèi)，反應(yīng)物顏色呈棕黃色。染色強度分為4級，分別為0～3分。分別代表無陽性染色(0分)、淺黃色(1分)、棕黃色(2分)、棕褐色(3分)。著色范圍分為4級(Ⅰ～Ⅳ級)：其中Ⅰ級表示無陽性細(xì)胞染色(0分)，Ⅱ級表示陽性細(xì)胞率<25%(1分)，Ⅲ級表示陽性細(xì)胞率范圍為26%～50%(2分)，Ⅳ級表示陽性細(xì)胞率>51%(3分)。在高倍鏡視野內(nèi)隨機選取100個細(xì)胞，計算陽性率，連續(xù)觀察5次求平均值。染色結(jié)果=染色強度×染色：陰性(-)、陽性(+)、中度陽性(+)以及強陽性(++)分別得分為0分、1～2分、3～6分和7～9分。本文判斷總結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)為≤2分判定為陰性，>2分判定為陽性。

1.3.3 PCDH10 RNA表達(dá)水平測定:采用TRIzol法使用總RNA提取試劑盒(購于賽默飛世爾中國公司)提取所有患者胃癌和癌旁組織中的總RNA ，使用紫外分光光度計(UV)測定提取出的總RNA濃度，樣品A260/A280≥1．80視為合格。然后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購于賽默飛世爾中國公司)將總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，分別得到模板單鏈cDNA，然后使PCR試劑盒以對cDNA進(jìn)行PCR。 PCR設(shè)置的PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min，95℃ 40 s，60℃ 20 s，72℃ 15 s；連續(xù)循環(huán)40次，然后采用2-ΔΔct分別計算PCDH10 RNA相對表達(dá)量(RQ)[8]。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：低表達(dá)組：≤0.5；高表達(dá)組：≥2；無顯著差異組：0.5～2。

1.3.4 NQOlC609T基因分型:引物F和R分別為：5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’；5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，循環(huán)30次后70℃延伸10 min。使用PCR對DNA模板擴增后生成212 bp片段，NQO1基因CC只可見212 bp，TT和CT基因型發(fā)生C→T基因突變后分別可見83和129 bp、83、129以及212 bp 條帶，且CC基因型不存在Hinf I酶切位點，TT基因出現(xiàn)HinfI酶切位點。

2 結(jié)果

2.1 2組患者組織DLC-1表達(dá)情況比較 吸煙組患者DLC-1陽性表達(dá)比例顯著低于不吸煙組患者(P<0.05)。另外染色結(jié)果表明：DLC-1在正常胃組織、癌旁組織和癌組織中表達(dá)水平分別呈現(xiàn)高表達(dá)、中表達(dá)、低表達(dá)，免疫反應(yīng)性逐漸減弱。見表1，圖1。

圖1 DLC-1在正常胃組織(A)、癌旁組織(B)和胃癌組織(C)中的免疫組織化學(xué)染色圖(×200)

2.2 2組患者血清PCDH10 mRNA表達(dá)量比較 吸煙組患者PCDH10 mRNA表達(dá)量顯著高于不吸煙組(P<0.05)，且2組患者胃癌組織PCDH10 mRNA表達(dá)量顯著高于癌旁組織(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者血清PCDH10 mRNA表達(dá)量比較

2.3 NQO1基因多態(tài)性與吸煙胃癌患者Logistic回歸分析 Logistic回歸分析結(jié)果顯示NQO1基因多態(tài)性與吸煙胃癌患者之間存在密切相關(guān)性(P<0.05)。吸煙組胃癌患者攜帶NQO1CT和TT基因型的概率明顯高于不吸煙組(P<0.05)。見表3。

表3 NQO1基因多態(tài)性與吸煙胃癌患者Logistic回歸分析

2.4 胃癌患者ESD術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素分析 隨訪1年后失訪患者6例(死亡1例，隨訪資料不完整5例)，共有196例患者納入研究分析。其中65例患者胃癌復(fù)發(fā)，131例患者未復(fù)發(fā)。分析結(jié)果顯示：ESD術(shù)后是否發(fā)生胃癌復(fù)發(fā)與患者性別、年齡、病理類型以及分期無顯著關(guān)系(P>0.05)；而術(shù)后發(fā)生胃癌復(fù)發(fā)患者DCL-1陰性、胃癌組織PCDH10 mRNA水平以及NQO1基因CT和TT型比例均顯著高于未復(fù)發(fā)組患者(P<0.05)。見表4。

表4 胃癌患者ESD術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素分析 例

2.5 影響胃癌患者ESD術(shù)后復(fù)發(fā)的多因素分析 將表5中對于胃癌患者ESD術(shù)后復(fù)發(fā)具有統(tǒng)計學(xué)意義的影響因素進(jìn)行Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)DCL-1陰性率、胃癌組織PCDH10 mRNA水平以及NQO1基因多態(tài)性均與胃癌患者ESD術(shù)后復(fù)發(fā)存在密切相關(guān)性(P<0.05)。見表5。

表5 影響胃癌患者ESD術(shù)后復(fù)發(fā)的多因素分析

3 討論

胃癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率均較高，且目前我國胃癌發(fā)病人數(shù)呈逐漸上升和年輕化趨勢，對患者健康造成嚴(yán)重威脅[9]。ESD作為目前臨床上治療胃癌的微創(chuàng)手術(shù)，其相比傳統(tǒng)開放性術(shù)式具有創(chuàng)傷更小、患者恢復(fù)時間短等優(yōu)勢，深受患者和醫(yī)生歡迎，但部分患者在行ESD術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)仍是一個不容忽視的問題[10]。吸煙作為腫瘤常見危險因素和影響腫瘤預(yù)后的獨立因素，近來有研究證實吸煙與多種腫瘤易感基因多態(tài)性存在交互效應(yīng)，即吸煙等危險環(huán)境因素會放大基因突變對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響[11]。

NQO1是人體內(nèi)較為重要的Ⅱ相反應(yīng)酶之一，可以通過促進(jìn)還原反應(yīng)發(fā)生減輕醌類等有害化合物對機體細(xì)胞的致癌致畸作用。已有的研究證實，NQO1基因存在多態(tài)性，且突變型基因(CT或TT)形成的蛋白產(chǎn)物穩(wěn)定性不佳，會快速發(fā)生降解，且若其為純合突變基因型(TT)則穩(wěn)定性更差[12]。陳道俊等[13]研究結(jié)果表明NQO1基因多態(tài)性與吸煙存在交互作用，且發(fā)生純合突變的NQO1 TT1型者吸煙對胃癌的影響效應(yīng)更加嚴(yán)重。本文研究結(jié)果顯示，NQO1基因多態(tài)性與吸煙胃癌患者之間存在密切相關(guān)性(P<0.05)。吸煙組胃癌患者攜帶NQ01CT和TT基因型的概率明顯高于不吸煙組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。且預(yù)后研究結(jié)果顯示術(shù)后發(fā)生胃癌復(fù)發(fā)患者的NQO1基因CT和TT型比例均顯著高于未復(fù)發(fā)組患者(P<0.05)，NQO1基因多態(tài)性均與胃癌患者ESD術(shù)后復(fù)發(fā)存在密切相關(guān)性(P<0.05)。推測原因主要是由于NQOI CT、TT基因型屬于胃癌易感基因類型，該基因型攜帶者本身發(fā)生胃癌風(fēng)險相對于CC型更高，而吸煙作為誘導(dǎo)因素，可能會促進(jìn)NQO1 基因發(fā)生CT或TT基因突變，且發(fā)生突變后其與對基因突變的交互作用會進(jìn)一步影響和加劇胃癌的發(fā)生發(fā)展，從而影響患者預(yù)后和術(shù)后復(fù)發(fā)情況[14]。

腫瘤發(fā)生的重要機制是機體癌基因激活和抑癌基因失活之間的平衡被打破。DLC-1是表達(dá)于人體正常組織中的一種抑癌基因；有研究證實，DLC-1在多種腫瘤組織中表現(xiàn)為低表達(dá)甚至缺失[4]。本研究結(jié)果表明，吸煙組患者DLC-1陽性表達(dá)患者比例顯著低于不吸煙組患者，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。且DLC-1在正常胃組織、癌旁組織和癌組織中表達(dá)水平分別呈現(xiàn)高表達(dá)、中表達(dá)、低表達(dá)，免疫反應(yīng)性逐漸減弱。且預(yù)后研究Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)DCL-1陰性與胃癌患者ESD術(shù)后復(fù)發(fā)存在密切相關(guān)性(P<0.05)。黃永平等[15]研究結(jié)果說明DLC-1表達(dá)水平與腫瘤分期和惡性程度存在密切聯(lián)系，一般DLC-1陰性表達(dá)者惡性程度更高。而腫瘤N分期、LNR作為腫瘤預(yù)后重要判斷指標(biāo)，會嚴(yán)重影響腫瘤預(yù)后。同時有研究表明DLC-1 mRNA雖然也會在正常組織中表達(dá)，但啟動子區(qū)域不會發(fā)生無甲基化，而DLC-1 mRNA 在胃癌組織中表現(xiàn)為低表達(dá)甚至不表達(dá)，且甲基化陳程度高達(dá)35%左右[11]。說明DLC-1 mRNA 表達(dá)量與DLC-1啟動子的過度甲基化程度存在顯著負(fù)相關(guān)性[16]。Sotillos等[17]研究進(jìn)一步表明啟動子區(qū)域高甲基化可能會增加多種癌細(xì)胞如結(jié)直腸癌、肝癌以及胃癌等DLC-1基因失活的概率。以上研究均說明了DLC-1在各類癌組織中更傾向于陰性表達(dá)，而吸煙作為胃癌獨立危險因素，可能是通過誘導(dǎo)DLC-1啟動子區(qū)域甲基化加劇了DLC-1mRNA陰性表達(dá)，從而對患者預(yù)后造成不良影響。

PC-DH10作為惡性腫瘤相關(guān)基因之一，其在多種惡性腫瘤發(fā)展進(jìn)程中可以發(fā)揮抑制癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移作用。劉培根[18]研究報道PC-DH10基因的啟動子區(qū)域會發(fā)生過度甲基化現(xiàn)象，而腫瘤發(fā)生增殖時，啟動子區(qū)域的過度甲基化會促進(jìn) miRNA轉(zhuǎn)錄。本文研究結(jié)果顯示吸煙組患者PCDH10 mRNA表達(dá)量顯著高于不吸煙組(P<0.05)，且2組患者胃癌組織PC-DH10 mRNA表達(dá)量顯著高于癌旁組織(P<0.05)；Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)胃癌組織PC-DH10 mRNA水平與胃癌患者ESD術(shù)后復(fù)發(fā)存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。而林瑩等[19]研究結(jié)果顯示胃癌病灶內(nèi)PCDH10的mRNA表達(dá)水平反而低于癌旁組織。Shishodia等[20]研究表明乳腺癌患者中乳腺癌組織的PCDH家族中的PCDH7基因表達(dá)水平顯著高于正?；颊吆桶┡越M織。說明關(guān)于PC-DH10對于腫瘤發(fā)生發(fā)展作用機制尚未完全揭示，其與腫瘤預(yù)后之間的關(guān)系需要進(jìn)一步深入研究證實，且PC-DH10家族中各亞型基因?qū)δ[瘤作用機制可能不完全相同。

綜上所述，NQOI基因多態(tài)性、DLC-1陰性和PCDH10高表達(dá)以及吸煙會增加胃癌的發(fā)生風(fēng)險，且DLC-1陰性與胃癌ESD術(shù)后復(fù)發(fā)存在顯著負(fù)相關(guān)，PCDH10表達(dá)水平和NQO1基因多態(tài)性及吸煙與胃癌ESD術(shù)后復(fù)發(fā)存在顯著正相關(guān)。