符國奮 梁海梅 王志峰 顏洪順 符之月

肺癌是全球常見且病死率較高的惡性腫瘤，分子靶向治療是新的治療方式，也是未來研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)，其可針對性的通過特異性靶點(diǎn)進(jìn)行治療[1]。因此，尋找特異性靶點(diǎn)是分子靶向治療的關(guān)鍵和重點(diǎn)。研究表明，lncRNA參與肺癌的發(fā)生發(fā)展過程，可作為肺癌的分子標(biāo)志物[2]。腫瘤翻譯調(diào)控蛋白1(tumor protein translationally-controlled 1，TPT1)反義RNA1(TPT1 antisense RNA 1，TPT1-AS1)是一種lncRNA，研究報(bào)道TPT1-AS1在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，與TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移及患者生存率相關(guān)，可作為臨床預(yù)后判斷的參考指標(biāo)[3]。TPT1-AS1在上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)移組織和細(xì)胞系中也高表達(dá)，與FIG0分期，腫瘤大小和腫瘤分化密切相關(guān)；TPT1-AS1通過誘導(dǎo)TPT1表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，遷移和侵襲[4]。然而TPT1-AS1對肺癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的影響及機(jī)制尚不清楚。研究報(bào)道m(xù)iRNA也參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，研究報(bào)道m(xù)iR-30c的低表達(dá)通過誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)促進(jìn)細(xì)胞侵襲[5]。lncRNA DLEU2通過下調(diào)miR-30c-5p可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[6]。但TPT1-AS1是否通過調(diào)控miR-30c影響肺癌的發(fā)生發(fā)展還不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究TPT1-AS1對肺癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的影響及機(jī)制是否與miR-30c有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取瓊海市人民醫(yī)院2017年1月至2019年1月收治的肺癌患者34例，患者經(jīng)手術(shù)切除癌組織，距離癌組織邊緣2～5 cm處切除的為癌旁組織。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理組織切片檢測確診為肺癌；②術(shù)前未進(jìn)行過放化療；③臨床病理及隨訪資料完整；④患者均知情且同意。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①心、肝臟、腎等功能不齊全者；②患有嚴(yán)重精神疾病者；③合并其他腫瘤者。

1.3 材料 肺癌細(xì)胞A549購自上海酶研生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自上海羽朵生物科技有限公司；吉姆薩染色液購自北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Transwell小室購于美國BD公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 肺癌細(xì)胞A549用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，2 d換液1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將pcDNA3.1、pcDNA3.1-TPT1-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-30c分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，記為pcDNA3.1組、pcDNA3.1-TPT1-AS1組、anti-miR-NC組、anti-miR-30c組。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測TPT1-AS1和miR-30c表達(dá)水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，提取總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進(jìn)行PCR，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，循環(huán)條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長5 min。相對表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。TPT1-AS1和miR-30c分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，TPT1-AS1上游引物序列：5’-CTCCCAA

AGTGCTGGGATTA-3’，下游引物序列：5’-TTTAGGAA

GATGGGCAAGGA-3’；GAPDH上游引物序列：5’-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3’，下游引物序列：5’-CTCCACGACGTACTCAGCG-3’；miR-30c上游引物序列：5’-TGTAAACATCCTACACTCTCAGCAA-3’，下游引物序列：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 2組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，并制備單細(xì)胞懸液，加入3 ml預(yù)冷的70%乙醇固定，用緩沖液洗滌后加入核糖核酸酶A(RNase A)于37℃水浴30 min，加入碘化啶(PI)，避光30 min，上機(jī)檢測，重復(fù)3次。用流式細(xì)胞儀和DNA細(xì)胞周期分析軟件對細(xì)胞周期進(jìn)行檢測分析。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成數(shù) 取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，制成1×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液，以每孔100個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)2周出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)終止培養(yǎng)，PBS清洗2遍，甲醇固定15 min，吉姆薩染色30 min，在低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.8 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá) 適量RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入將稀釋好的一抗(1∶500稀釋)，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜，加入按照1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔的二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯色，暗室下顯影、定影。Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值。蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 Transwell檢測細(xì)胞遷移 Transwell小室上室加100 μl細(xì)胞懸液，下室加500 μl含血清培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)板，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS漂洗2遍，棉簽擦拭掉上層細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡(×200)下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，拍照記錄并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測TPT1-AS1對miR-30c的靶向調(diào)控 構(gòu)建含miR-30c結(jié)合位點(diǎn)的TPT1-AS1的野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-TPT1-AS1和MUT-TPT1-AS1，用LipofectamineTM 2000將WT-TPT1-AS1和MUT-TPT1-AS1分別與miR-NC和miR-30c共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中。按照說明書檢測熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 TPT1-AS1在肺癌中的表達(dá) 與癌旁組織比較，肺癌組織中TPT1-AS1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 TPT1-AS1的表達(dá)

2.2 過表達(dá)TPT1-AS1對A549增殖的影響 與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-TPT1-AS1組G0期細(xì)胞所占比例顯著降低(P<0.05)，S期細(xì)胞所占比例顯著升高(P<0.05)，G2期細(xì)胞所占比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著升高(P<0.05)，Ki67表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 Ki67蛋白的表達(dá)

表2 過表達(dá)TPT1-AS1對A549增殖的影響

2.3 過表達(dá)TPT1-AS1對A549遷移的影響 與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-TPT1-AS1組TPT1-AS1表達(dá)水平顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)顯著升高，E-cadherin表達(dá)水平顯著降低，N-cadherin表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 過表達(dá)TPT1-AS1對A549遷移的影響

圖2 E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達(dá)

2.4 TPT1-AS1靶向miR-30c Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示TPT1-AS1與miR-30c存在結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，與miR-NC組比較，miR-30c組中轉(zhuǎn)染野生型表達(dá)載體WT-TPT1-AS1的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染突變型表達(dá)載體MUT-TPT1-AS1的細(xì)胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-TPT1-AS1組miR-30c表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖3，表4、5。

圖3 TPT1-AS1靶向miR-30c

表4 TPT1-AS1靶向miR-30c

表5 TPT1-AS1調(diào)控miR-30c

2.5 抑制miR-30c對A549增殖、遷移的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-30c組miR-30c表達(dá)水平顯著降低，G0期細(xì)胞所占比例顯著降低，S期細(xì)胞所占比例顯著升高(P<0.05)，G2期細(xì)胞所占比例變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)顯著升高，Ki67、N-cadherin表達(dá)水平顯著升高，E-cadherin表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖4，表6、7。

圖4 Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達(dá)

表6 抑制miR-30c對A549增殖、遷移的影響

表7 Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達(dá)

3 討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，腫瘤靶向藥物逐漸成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)，越來越多的靶向藥物進(jìn)入臨床；研究肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制有利于尋找新的靶點(diǎn)以用于開發(fā)新的靶向藥物[7]。研究表明lncRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，深入研究lncRNA在腫瘤中的作用機(jī)制，可能為腫瘤診療提供新的方法[8]。研究報(bào)道lncRNA TPT1-AS1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中差異表達(dá)，是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中臨床相關(guān)的lncRNA生物標(biāo)記[9]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TPT1-AS1上調(diào)表達(dá)，TPT1-AS1可以競爭性地結(jié)合miR-770-5p，從而調(diào)節(jié)STMN1的表達(dá)。以抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬并促進(jìn)增殖[10]。TPT1-AS1在子宮頸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，高表達(dá)的TPT1-AS1與患者不良預(yù)后特征和不良生存率顯著相關(guān)，TPT1-AS1的過表達(dá)通過充當(dāng)miR-324-5p的海綿可促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞集落形成、增殖、遷移、侵襲和EMT進(jìn)程[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肺癌組織中TPT1-AS1高表達(dá)，說明TPT1-AS1可能參與了肺癌的進(jìn)展。為進(jìn)一步研究TPT1-AS1對肺癌的影響，轉(zhuǎn)染TPT1-AS1過表達(dá)載體，結(jié)果顯示，G0期細(xì)胞所占比例顯著降低，S期細(xì)胞所占比例顯著升高，G2期細(xì)胞所占比例無顯著變化；細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)顯著升高，Ki67、N-cadherin表達(dá)水平顯著升高，E-cadherin表達(dá)水平顯著降低。Ki67是細(xì)胞增殖標(biāo)志物，N-cadherin、E-cadherin是EMT過程的標(biāo)志物，其表達(dá)水平與細(xì)胞遷移有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TPT1-AS1過表達(dá)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞從G0期到S期轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞的克隆形成和遷移。

研究表明miRNA參與調(diào)控腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等進(jìn)展[12]。研究報(bào)道胰腺癌組織中miR-30c低表達(dá)，高表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，并預(yù)示預(yù)后不良[13]。miR-30c過表達(dá)直接靶向BCL9抑制了大腸癌的增殖[14]。miR-30c通過靶向Y染色體上的性別決定區(qū)相關(guān)高遷移率族盒蛋白9(sex determining region Y-related high mobility group box protein 9，SOX9)可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和遷移[15]。miR-30c的下調(diào)通過靶向轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(metastasis-associated protein 1，MTA1)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的侵襲[16]。本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染miR-30c抑制表達(dá)載體后，G0期細(xì)胞所占比例顯著降低，S期細(xì)胞所占比例顯著升高，G2期細(xì)胞所占比例無顯著變化；細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)顯著升高，Ki67、N-cadherin表達(dá)水平顯著升高，E-cadherin表達(dá)水平顯著降低。說明抑制miR-30c表達(dá)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和遷移，與前人研究結(jié)果相符。且本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)TPT1-AS1可靶向調(diào)控miR-30c的表達(dá)。

提示，過表達(dá)TPT1-AS1可能通過下調(diào)miR-30c促進(jìn)肺癌細(xì)胞從G0期到S期轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞的克隆形成和遷移。