黃元城，郭文磊，王正加

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

LBD轉(zhuǎn)錄因子是一類在其蛋白質(zhì)N端具有側(cè)生器官邊界(LOB)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的植物特有轉(zhuǎn)錄因子[1]。SHUAI等[2]首次發(fā)現(xiàn)了LBD基因，發(fā)現(xiàn)它在植物側(cè)生器官的邊界細(xì)胞中表達(dá)并且參與側(cè)生器官的發(fā)育形成。根據(jù)側(cè)生器官邊界(LOB)域的結(jié)構(gòu)，擬南芥Arabidopsisthaliana中的LBD轉(zhuǎn)錄因子家族通?？杀环譃?類。類1(Group 1)具有1個(gè)完整的高度保守的CX2CX6CX3C鋅指結(jié)構(gòu)，通常能夠結(jié)合特定DNA序列。同時(shí)類1的LBD基因具有高度保守的甘氨酸GAS結(jié)構(gòu)和亮氨酸拉鏈(zipper-like)結(jié)構(gòu)(LX6LX3LX6L)，它們之間會(huì)形成卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)并相互作用。而類2(Group 2)只含有1個(gè)保守的CX2CX6CX3C鋅指結(jié)構(gòu)[1?4]。大多數(shù)的LBD轉(zhuǎn)錄因子基因從屬于類1。類2的LBD蛋白質(zhì)往往保存有1個(gè)可能不具有功能的殘缺的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，它會(huì)形成1個(gè)盤繞-線圈結(jié)構(gòu)[4]。最近，CHEN等[5]通過研究小麥TriticumaestivumLBD蛋白質(zhì)中LOB結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)，揭示了之前提到的CX2CX6CX3C鋅指結(jié)構(gòu)實(shí)際是C4型鋅指結(jié)構(gòu)。C4鋅指結(jié)構(gòu)常常與GAS結(jié)構(gòu)以及α4和α5之間的垂直構(gòu)象共同作用，從而精確識(shí)別DNA，并能對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的空間構(gòu)型進(jìn)行定位。最初的一些LBD基因功能研究表明：LBD基因通常在側(cè)生器官底部的邊界新生細(xì)胞中表達(dá)，在器官分化和側(cè)生器官發(fā)育中具有潛在功能[1]。同時(shí)，LBD基因還能夠參與植物花青素、氮元素代謝和器官再生等關(guān)鍵過程[6]。類1的LBD基因大多數(shù)參與植物發(fā)育過程[4,7]和由生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)的側(cè)根形成過程。相反，類2基因往往作為花青素合成的阻遏物和有效性信號(hào)參與了新陳代謝過程[8]。在擬南芥LBD轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式研究中，病原體幾乎誘導(dǎo)了類2的所有LBD基因的表達(dá)，這表明LBD基因能夠在植物病原防御反應(yīng)中發(fā)揮作用[9]。LBD基因參與到擬南芥許多組織發(fā)育過程中，比如葉片發(fā)育[10]、根部側(cè)生器官發(fā)育[11?13]、細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]和赤霉素途徑[15]。值得一提的是，擬南芥中的AthLBD16基因會(huì)促進(jìn)側(cè)根的起始發(fā)育[16]，AthLBD29則能夠抑制擬南芥莖纖維壁增厚的生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[17]。在尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum中AtLBD20作為易感基因似乎能夠調(diào)節(jié)茉莉酸(JA)信號(hào)傳導(dǎo)和激活尖孢鐮刀菌中JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程依賴的反應(yīng)[18]。除擬南芥之外LBD基因功能在許多物種中同樣被研究過，如OsIG1基因會(huì)參與配子發(fā)生過程并影響水稻Oryzasativa的花器官數(shù)量[19]；MdLBD13蛋白質(zhì)則可以抑制蘋果Malus×domestica中的花色苷合成和氮吸收[20]。與此同時(shí)，在許多物種中也開展了利用基因組數(shù)據(jù)資源對(duì)LBD基因家族鑒定和分析的研究，如茶樹Camelliasinensis[21]、馬鈴薯Solanumtuberosum[22]、桉樹Eucalyptusrobusta[23]、蕓薹Brassicacampestris[24]、葡萄Vitisvinifera[25]、大豆Glycinemax[26]。但是目前薄殼山核桃Caryaillinoensis中的LBD基因研究卻鮮有報(bào)道。在薄殼山核桃全基因組測序組裝完成后LBD基因家族仍然沒有進(jìn)行系統(tǒng)的研究[27]。本研究通過生物信息學(xué)手段鑒定了薄殼山核桃全基因組內(nèi)的LBD基因，分析其基因結(jié)構(gòu)、基序(motif)分布、轉(zhuǎn)錄組表達(dá)模式并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，預(yù)測LBD基因家族在薄殼山核桃中可能的功能，并為進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 多物種全基因組蛋白質(zhì)序列獲取

薄殼山核桃、山核桃Caryacathayensis、核桃Juglansreiga的全基因組蛋白質(zhì)序列來源于胡桃科Juglandaceae數(shù)據(jù)庫(http://www.juglandaceae.net/)[28]。銀杏Ginkgobiloba、無油樟Amborellatrichopoda、藍(lán)星睡蓮Nymphaeacoloratar、大豆、葡萄、水稻的全基因組蛋白質(zhì)序列來源于美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)。擬南芥的全基因組蛋白質(zhì)序列來源于擬南芥信息資源庫(TAIR，https://www.arabidopsis.org/)。

1.2 LBD轉(zhuǎn)錄因子基因的鑒定與蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

以LBD為關(guān)鍵詞，搜索獲取LBD在擬南芥中的10條核酸編碼序列(CDS)，并下載這10條基因的FASTA格式的核酸序列。將獲得的10條擬南芥編碼序列通過本地NCBI-BLAST 2.9.0軟件的BLASTX程序與1.1中獲得的全基因組蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源比對(duì)，在Pfam數(shù)據(jù)庫[29]中下載LOB結(jié)構(gòu)域的種子文件，得到的候選LBD蛋白質(zhì)序列用HMMER軟件[30]使用隱馬爾科夫模型算法篩選出LBD基因，利用ExPASy蛋白質(zhì)在線分析網(wǎng)站對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行理化性質(zhì)的鑒定和分析。

1.3 LBD 基因組共線性區(qū)塊分析

通過MCSCAN軟件[31]，將薄殼山核桃全基因組核酸編碼序列CDS文件和基因組注釋GFF文件輸入執(zhí)行Pairwise Synteny Search程序，得到的Anchor Pairwise結(jié)果以30個(gè)基因?yàn)殚撝颠^濾小片段block。在最后的gene block中尋找1.2中鑒定到的LBD基因。

1.4 LBD 基因多重序列比對(duì)

利用ENSEMBL的CLUSTALW軟件[32]對(duì)獲取的52條薄殼山核桃LBD基因進(jìn)行多重序列比對(duì)，將比對(duì)后的ALN文件輸入至ENDscript網(wǎng)站進(jìn)行多序列比對(duì)的可視化。

1.5 LBD 基因系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)和基序分析

利用MUSCLE v3.8.31軟件[33]分別對(duì)獲取的52條薄殼山核桃和547條多物種LBD基因的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)。獲得的多序列比對(duì)結(jié)果文件使用FastTree V2.1.11軟件[34]的JTT+CAT算法[35]構(gòu)建最大似然樹，獲得的樹文件通過Evolview在線網(wǎng)站[36]可視化。在胡桃科數(shù)據(jù)庫下載薄殼山核桃基因組結(jié)構(gòu)注釋GFF文件，并利用Gene Structure Display Server 2.0在線網(wǎng)站[37]可視化LBD基因結(jié)構(gòu)圖。在MEME網(wǎng)站上傳52條薄殼山核桃蛋白質(zhì)序列分析基序。

1.6 LBD 基因表達(dá)模式分析

轉(zhuǎn)錄組原始測序數(shù)據(jù)從NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) PRJNA435846下的SRA數(shù)據(jù)庫獲取：SRR6793964、SRR6793963、SRR6793962、SRR6793961、SRR6793960、SRR6793959、SRR6793958、SRR6793957、SRR6793956、SRR6793955。從GIGADB (http://gigadb.org/)獲取薄殼山核桃全基因組序列和基因組注釋GFF文件，利用fastp軟件進(jìn)行質(zhì)控和過濾，STAR軟件進(jìn)行序列比對(duì)，RSEM軟件對(duì)基因進(jìn)行定量分析，計(jì)算TPM值并生成基因表達(dá)數(shù)據(jù)框。得到的表達(dá)數(shù)據(jù)通過R軟件將表達(dá)值進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后利用pheatmap包繪制表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LBD 基因鑒定與蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

通過BLASTX初篩出LBD的同源基因，經(jīng)HMM-SEARCH程序[29]分析和篩選，供試的10個(gè)物種中共獲得551條LBD基因(表1)。其中大豆中LBD基因的數(shù)量是無油樟的4.46倍、核桃的1.61倍，推測這可能和大豆是由古四倍體演化而來的二倍體有關(guān)[38]。根據(jù)薄殼山核桃基因組GFF注釋文件，發(fā)現(xiàn)有pecanLBD50、pecanLBD51和pecanLBD52等3個(gè)基因是位于scaffold123681的短串聯(lián)重復(fù)基因。

表 1 多物種 LBD 基因鑒定結(jié)果Table 1 Identify result of LBD genes in multi-species

MCSCAN分析顯示：薄殼山核桃基因組共有211個(gè)共線性的區(qū)塊。在這些共線性的區(qū)塊中找到了13對(duì)在可能全基因組加倍事件中發(fā)生重復(fù)的同源LBD基因?qū)Γ簆ecanLBD1和pecanLBD25、pecanLBD4和pecanLBD17、pecanLBD5和pecanLBD16、pecanLBD11和pecanLBD33、pecanLBD11和pecanLBD32、pecanLBD12和pecanLBD33、pecanLBD12和pecanLBD32、pecanLBD14和pecanLBD43、pecanLBD14和pecanLBD42、pecanLBD19和pecanLBD26、pecanLBD20和pecanLBD29、pecanLBD21和pecanLBD36、pecanLBD34和pecanLBD41。共線性分析共得到基因23個(gè)，占所有LBD基因的44.2%，這說明了全基因組加倍事件使LBD基因家族得到了擴(kuò)張。

通過理化性質(zhì)分析(表2)：在氨基酸數(shù)量、分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)和脂肪系數(shù)等方面存在差異。氨基酸數(shù)量為 92～326個(gè)，大部分為 170～300個(gè)；等電點(diǎn)為4.48～9.85，＞7.5的有24個(gè)，多在堿性范圍內(nèi)；不穩(wěn)定系數(shù)＜40的有51個(gè)，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)；＞40僅1個(gè)，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)的脂肪系數(shù)大多＜100，為疏水性蛋白質(zhì)，僅有pecanLBD50脂肪系數(shù)＞100，為親水性蛋白質(zhì)。

表 2 薄殼山核桃LBD轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白質(zhì)理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of LBD transcription factor family protein in C.illinoensis

表 2 (續(xù))Table 2 Continued

2.2 薄殼山核桃LBD基因系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)和基序分析

如圖1所示：52個(gè)薄殼山核桃LBD基因聚成3類：GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅢ。其中，GroupⅠ含有最多的33個(gè)LBD基因，它們可能承擔(dān)了LBD基因促進(jìn)側(cè)生器官發(fā)育的主要功能。GroupⅠ中有1對(duì)蛋白質(zhì)序列完全相同的基因pecanLBD22和pecanLBD48，導(dǎo)致它們?cè)谶M(jìn)化樹上沒有顯示變異，而pecanLBD41的進(jìn)化枝長度達(dá)到3.734 6，是GroupⅠ中相對(duì)于其他LBD基因變異程度最大的。GroupⅡ細(xì)分為3支基因簇，其中 Sub groupⅠ和Sub groupⅢ的進(jìn)化枝相對(duì)較短，因此序列和功能變異不大；而Sub groupⅡ有明顯的進(jìn)化變異，其中pecanLBD6的枝長為6.274 8，是Sub groupⅡ中變異最大的基因，它可能已經(jīng)出現(xiàn)了功能上的分化變異。GroupⅢ是3類中最保守的一支，其中的pecanLBD9基因的枝長在所有52個(gè)LBD基因中最長，達(dá)6.764 2。

圖 1 薄殼山核桃LBD基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 1 Phylogenetic tree constructed based on the full-length sequences of pecan LBD genes using JTT+CAT algorithm with FastTree software

如圖2中52個(gè)薄殼山核桃LBD基因基序分析結(jié)果所示：共發(fā)現(xiàn)了10個(gè)基序并命名為Motif1～Motif10。對(duì)LBD轉(zhuǎn)錄因子家族較重要的有3個(gè)基序：Motif1含GAS(Gly-Ala-Ser)甘氨酸保守結(jié)構(gòu)；Motif 2擁有完整的高度保守的CX2CX6CX3C鋅指結(jié)構(gòu)，通常具有結(jié)合特定DNA序列的能力；Motif 3 為亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(LX6LX3LX6L)。Motif1和Motif3往往會(huì)形成卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)并相互作用。52個(gè)薄殼山核桃LBD基因中的39個(gè)具有完整的Motif1、Motif2和Motif3的順序基序結(jié)構(gòu)；而pecanLBD34、pecanLBD41和pecanLBD9在進(jìn)化過程中丟失了 Motif1的 GAS甘氨酸保守結(jié)構(gòu)；pecanLBD6、pecanLBD19、pecanLBD26、pecanLBD45、pecanLBD37、pecanLBD2 和pecanLBD3 丟失了Motif3亮氨酸zipper-like結(jié)構(gòu)(LX6LX3LX6L)，盡管它們?nèi)跃哂蠫AS結(jié)構(gòu)但已經(jīng)喪失了和Motif1結(jié)合生成卷曲-螺旋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能；pecanLBD50則丟失了所有的基序，可能喪失了LBD基因的基本功能。

圖 2 薄殼山核桃LBD轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)發(fā)育樹和保守蛋白質(zhì)基序結(jié)構(gòu)Figure 2 Phylogenetic tree constructed based on the full-length sequences of pecan LBD genes using JTT+CAT algorithm with FastTree software

基因結(jié)構(gòu)分析顯示：薄殼山核桃LBD基因一般具有1～3個(gè)外顯子。其中pecanLBD41～pecanLBD52都只具有1個(gè)外顯子(除pecanLBD47有2個(gè)外顯子除外)，并且都屬于GroupⅠ；具有3個(gè)外顯子的基因只有pecanLBD3、pecanLBD34和pecanLBD9，在每類都有部分；剩余的LBD基因都為2個(gè)外顯子，占所有薄殼山核桃LBD基因的67.3%。因此，薄殼山核桃LBD轉(zhuǎn)錄因子家族的大多數(shù)基因較為保守，有著相似的基序、基因結(jié)構(gòu)，執(zhí)行并發(fā)揮LBD的主要功能，而其發(fā)生變異的小部分可能已經(jīng)丟失了原來的基因功能或者特化出新的功能。

2.3 薄殼山核桃 LOB 結(jié)構(gòu)域多序列比對(duì)

對(duì)52個(gè)薄殼山核桃LBD轉(zhuǎn)錄因子基因的LOB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域多序列比對(duì)(圖3)發(fā)現(xiàn)：LOB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域主要由3個(gè)保守序列模式組成：長度為16個(gè)氨基酸的CX2CX6CX3C鋅指結(jié)構(gòu)、長度為50個(gè)氨基酸的甘氨酸GAS結(jié)構(gòu)和LX6LX3LX6L亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。其中pecanLBD50和pecanLBD21完全缺失了鋅指結(jié)構(gòu)和部分的甘氨酸GAS結(jié)構(gòu)，而其他的LBD的鋅指結(jié)構(gòu)則全部保存下來沒有發(fā)生缺失或者突變，較為保守。甘氨酸GAS結(jié)構(gòu)相對(duì)鋅指結(jié)構(gòu)變異程度較大，GroupⅠ中pecanLBD23～pecanLBD47、pecanLBD10、pecanLBD51發(fā)生了1～2個(gè)氨基酸的變異，GroupⅡ中 pecanLBD6、pecanLBD19、pecanLBD26、pecanLBD45、pecanLBD37、pecanLBD2、pecanLBD3等7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子GAS中的丙氨酸突變?yōu)榫彼帷⒔z氨酸突變?yōu)楸彼幔?2個(gè)LBD轉(zhuǎn)錄因子中有12個(gè)發(fā)生了突變，2個(gè)缺失了GAS結(jié)構(gòu)。LX6LX3LX6L亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)中，上述7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的第1個(gè)亮氨酸位置都突變?yōu)楦拾彼幔?個(gè)亮氨酸位置突變?yōu)楦拾彼峄蛱K氨酸，有5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的第2個(gè)亮氨酸位置發(fā)生了突變，由此可見上述7個(gè)LBD轉(zhuǎn)錄因子與進(jìn)化模式(圖1)一致，已經(jīng)發(fā)生了較大程度的變異，可能已經(jīng)分化出新的功能。pecanLBD15、pecanLBD47、pecanLBD10、pecanLBD51、pecanLBD52、pecanLBD7 和 pecanLBD24 的第2個(gè)亮氨酸位置發(fā)生了突變，第3個(gè)亮氨酸位置只有pecanLBD40、pecanLBD23和pecanLBD10發(fā)生了突變，相對(duì)保守。

圖 3 薄殼山核桃LBD 轉(zhuǎn)錄因子家族LOB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域多序列比對(duì)Figure 3 Multiple sequence alignment of LOB domain in C.illinoensis transcription factor family

2.4 顯花植物L(fēng)BD轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖4可見：與薄殼山核桃LBD系統(tǒng)發(fā)育樹相似，圖4中各物種LBD轉(zhuǎn)錄因子可以聚為3類：GroupⅠ、GroupⅡ和 GroupⅢ。其中 GroupⅠ有 314個(gè) LBD基因，為總數(shù)的 57.0%，占比最多；GroupⅡ有166個(gè)LBD基因，占總數(shù)的30.1%；而GroupⅢ的基因數(shù)量最少，只有71個(gè)，占總數(shù)的12.9%。從表1鑒定到的LBD轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量來看，裸子植物銀杏的數(shù)量是早期被子植物類群的2倍，這與銀杏最近一次特異性的WGD事件有關(guān)[39]；早期被子植物類群和單子葉植物水稻的LBD基因數(shù)量接近；而雙子葉植物的LBD基因數(shù)量明顯又發(fā)生了1次倍增。從分布來看，GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ中每個(gè)植物類群都存在LBD基因，因此LBD轉(zhuǎn)錄因子家族可能在裸子植物和被子植物未分化前已經(jīng)分為3類，分化后3類LBD繼續(xù)各自進(jìn)化。從變異程度看GroupⅠ和GroupⅡ相對(duì)較為保守，而GroupⅢ內(nèi)的所有LBD基因共享一支較長的分支，說明它們已發(fā)生了較大的變異，可能已經(jīng)分化出新的功能。

圖 4 利用從裸子植物銀杏到高等植物551個(gè)LBD基因全長蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic tree constructed based on the full-length sequences of 551 LBD genes from gymnosperm ginkgo to higher angiosperms

2.5 薄殼山核桃LBD基因組織表達(dá)模式分析

為了探究LBD轉(zhuǎn)錄因子家族在胚發(fā)育的關(guān)鍵過程中的作用，從NCBI網(wǎng)站的SRA原始測序數(shù)據(jù)庫中下載了薄殼山核桃胚成熟過程中3個(gè)關(guān)鍵時(shí)期的原始測序數(shù)據(jù)：子葉伸展早期(early extended stage of cotyledon development)、子葉完全伸展期(fully extended stage of cotyledon development)、胚完全成熟期(fully matured stage of embryo)，并進(jìn)行分析和繪制聚類熱圖(圖5)。不同LBD基因和不同發(fā)育階段之間的表達(dá)模式有顯著差異。基因表達(dá)量可以聚為4類：①pecanLBD2、pecanLBD19和pecanLBD26在3個(gè)階段的表達(dá)量比較高；②pecanLBD30、pecanLBD3和pecanLBD37在子葉伸展早期和子葉完全伸展期表達(dá)；③pecanLBD11、pecanLBD18、pecanLBD8、pecanLBD25、pecanLBD6、pecanLBD42、pecanLBD13、pecanLBD52、pecanLBD17、pecanLBD35、pecanLBD1、pecanLBD43、pecanLBD29和pecanLBD44 僅在子葉伸展早期有表達(dá)；④其余的LBD基因在3個(gè)階段都不表達(dá)。從2.2中系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果來看：③類表達(dá)的14個(gè)LBD基因(78.6%)，屬于較為保守的Group I，因此它們?cè)谂甙l(fā)育過程中主要參與經(jīng)典的器官分化過程，加快子葉邊界新生的細(xì)胞分化。而①類表達(dá)的基因都是進(jìn)化枝較長、變異程度較大的GroupⅡ中Sub GroupⅡ的成員，可見GroupⅡ中Sub Group Ⅱ的LBD成員已經(jīng)發(fā)生了較大程度的變異，它們參與到胚發(fā)育的全程，可能與胚中營養(yǎng)物質(zhì)的積累過程和胚組織分生發(fā)育的過程密切相關(guān)。②類中pecanLBD30和pecanLBD3屬于GroupⅡ，pecanLBD37屬于GroupⅠ，它們?cè)诠δ苌峡赡芙橛冖兕惡廷垲?，即既參與了器官分化、細(xì)胞分裂的過程調(diào)控，又和胚中營養(yǎng)物質(zhì)積累的過程相關(guān)?？傮w上，薄殼山核桃胚發(fā)育過程中LBD基因功能較為保守，主要參與新生細(xì)胞分裂分化、子葉形態(tài)建成等，但GroupⅡLBD基因的變異程度較大，可能進(jìn)化出新的功能，在胚發(fā)育過程中發(fā)揮更加關(guān)鍵的作用。

圖 5 薄殼山核桃LBD 轉(zhuǎn)錄因子家族胚發(fā)育表達(dá)模式Figure 5 Transcriptome expression profile of LBD gene family in embryo development

3 結(jié)論與討論

本研究分別在銀杏、無油樟、藍(lán)星睡蓮、水稻、擬南芥、葡萄、大豆、核桃、山核桃和薄殼山核桃全基因組蛋白質(zhì)序列中系統(tǒng)鑒定了551個(gè)LBD基因。這些LBD基因包含典型的LOB結(jié)構(gòu)域，即1個(gè)含有DNA結(jié)合活性所需的 (CX2CX6CX3C)鋅指結(jié)構(gòu)、1個(gè)Gly-Ala-Ser(GAS)結(jié)構(gòu)和1個(gè)負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)二聚體化的亮氨酸拉鏈 (LX6LX3LX6L)結(jié)構(gòu)。根據(jù)LOB結(jié)構(gòu)域的組成模式和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果。薄殼山核桃52個(gè)LBD基因可分為GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ 3類。33個(gè)LBD基因被劃分為GroupⅠ，15個(gè)被劃分為GroupⅡ，4個(gè)為GroupⅢ。根據(jù)進(jìn)化枝的長度，GroupⅠ是數(shù)量較多同時(shí)也比較保守的一支，而GroupⅡ和 GroupⅢ都發(fā)生了一定程度的變異。

新基因功能產(chǎn)生或分化的一大動(dòng)力是基因重復(fù)，基因重復(fù)對(duì)物種提高環(huán)境適應(yīng)性至關(guān)重要[40]。在進(jìn)化過程中，重復(fù)的基因可能會(huì)經(jīng)歷功能分化、亞功能分化或功能丟失等多種過程[41]。基因重復(fù)通常會(huì)導(dǎo)致基因家族擴(kuò)張[42]。為了揭示薄殼山核桃LBD基因家族的復(fù)制機(jī)制，利用MCScanX對(duì)薄殼山核桃的基因組共線性區(qū)塊內(nèi)成對(duì)的LBD基因進(jìn)行篩選。根據(jù)目前的基因組內(nèi)LBD基因位置分析結(jié)果，薄殼山核桃基因組內(nèi)只存在1個(gè)連續(xù)3個(gè)LBD基因的串聯(lián)重復(fù)事件，但是存在13對(duì)23個(gè)由全基因組加倍產(chǎn)生的LBD基因共線性基因?qū)Α＿@說明全基因組加倍在LBD基因家族進(jìn)化中起到了主導(dǎo)性的推動(dòng)作用。

本研究構(gòu)建了以裸子植物(銀杏)、早期被子植物(無油樟、睡蓮)、單子葉植物(水稻)、雙子葉植物(擬南芥、葡萄、大豆)、近緣種植物(核桃、山核桃)和薄殼山核桃為顯花植物中主要類群的LBD基因系統(tǒng)發(fā)育樹。顯花植物L(fēng)BD系統(tǒng)發(fā)育樹與與薄殼山核桃LBD相似，同樣可以聚為3類。從分布來看，GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ中每個(gè)植物都存在LBD基因，因此LBD轉(zhuǎn)錄因子家族可能在裸子植物和被子植物未分化前已經(jīng)分化為3類。從變異程度看，GroupⅠ和GroupⅡ相對(duì)較為保守，而GroupⅢ內(nèi)的所有LBD基因共享一支較長的分支，說明已發(fā)生了較大的變異，可能已經(jīng)分化出新的功能。

LBD蛋白質(zhì)協(xié)調(diào)了很多植物發(fā)育過程，并對(duì)環(huán)境刺激作出反應(yīng)，特別是在調(diào)控側(cè)根器官發(fā)育和代謝過程中起著至關(guān)重要的作用。例如LBD18通過抑制LBD18 DNA-結(jié)合活性控制側(cè)根發(fā)育[43]。一般來說，主根受到側(cè)根過度生長的影響，會(huì)降低植物提取水分和養(yǎng)分的能力。在土壤中蔓延的側(cè)根過多，將增加被病原體攻擊的可能性。以前的一些工作已經(jīng)證明了這些預(yù)測。如LBD1通過抑制主根生長和維持側(cè)根萌發(fā)來控制鹽脅迫下的根結(jié)構(gòu)[44]。LBD基因由于其對(duì)一系列下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，成為植物病原體入侵的關(guān)鍵分子靶基因[7]。

在薄殼山核桃研究中胚的發(fā)育是非常重要的階段[45]，特別是胚內(nèi)蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、淀粉等重要營養(yǎng)物質(zhì)累積過程是薄殼山核桃研究的熱點(diǎn)[46?47]。本研究分析LBD轉(zhuǎn)錄因子家族在薄殼山核桃子葉伸展早期、子葉完全伸展期和胚完全成熟期3個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：薄殼山核桃LBD基因存在4種表達(dá)模式?？梢奓BD基因具有參與調(diào)控胚發(fā)育過程的功能，通?；谠趥?cè)生器官底部的邊界新生的細(xì)胞中調(diào)控細(xì)胞分裂分化來控制子葉的發(fā)育和形態(tài)建成。薄殼山核桃LBD基因中有在整個(gè)胚發(fā)育過程中都高表達(dá)的一簇基因，這些基因在胚發(fā)育過程中發(fā)揮了更加重要的作用，因此有必要對(duì)這一簇LBD基因進(jìn)行更為深入的基因功能研究，可為進(jìn)一步改良薄殼山核桃遺傳性狀提供基礎(chǔ)。