匡 婷，康佳文 ，郭思慧，李樂(lè)賽，張 勇

（1.湖南省腫瘤醫(yī)院/中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410013；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013）

根據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)，宮頸癌是女性生殖道排名第一的惡性腫瘤［1］，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的患者預(yù)后差［2-4］。外泌體是細(xì)胞主動(dòng)分泌的囊泡樣小體，能自由經(jīng)過(guò)淋巴管運(yùn)輸通道，可通過(guò)攜帶調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移的miRNAs，促進(jìn)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［5，6］。在本研究中，我們對(duì)宮頸癌淋巴結(jié)組織標(biāo)本進(jìn)行miRNAs的篩選及驗(yàn)證，探索外泌體攜帶的miRNA-217影響宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本收集與檢測(cè)患者簽署知情同意書(shū)，根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果選取淋巴結(jié)組織標(biāo)本，淋巴結(jié)陽(yáng)性（LN+）患者3例，淋巴結(jié)陰性（LN-）患者3例。RTqPCR 檢測(cè)淋巴結(jié)組織中miR-217，miR-9-5p和miR-338-3p含量。

1.2 RT-qPCR 檢測(cè)miRNA 表達(dá)Trizol法提取淋巴結(jié)組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR兩步法試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，50 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為參照，測(cè)定miR-217、miR-9-5p 和miR-338-3p基因水平，采用2-ΔΔCt法檢測(cè)各樣品基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物交由上海生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組Siha細(xì)胞為本室保存，人淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（HLEC）購(gòu)自德國(guó)海德?tīng)柋romoCell公司。細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)。用lenti-mCherry/miR-217轉(zhuǎn)染Siha細(xì)胞。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組為：空白組（Siha 細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（Siha 細(xì)胞慢病毒空載組，LV-NC）、陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組（Siha細(xì)胞慢病毒miR-217 沉默組，LV-miR-217-siRNA）。收集各組細(xì)胞外泌體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞外泌體的提取及鑒定依據(jù)試劑盒（ExoQuick-TC）說(shuō)明書(shū)提取宮頸癌Siha細(xì)胞分泌的外泌體，電鏡觀察形態(tài)，加蛋白裂解液提取蛋白，使用Hsc70，CD63 和CD81 抗體，進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)蛋白檢測(cè)鑒定外泌體。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力用胰酶消化收集轉(zhuǎn)染48h后的Siha細(xì)胞并計(jì)數(shù)，制成細(xì)胞密度為5×104單細(xì)胞懸浮液，三組不同細(xì)胞外泌體與細(xì)胞混和后，分別接種至Transwell小室中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。48 h后，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，用棉簽擦掉小室的下層細(xì)胞，顯微鏡觀察并拍照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)收集經(jīng)三組不同細(xì)胞外泌體處理的人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（HLECs），提取三組細(xì)胞蛋白，加入蛋白上樣緩沖液（5×），變性后，SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜并封閉，一抗（E-cad 1：1000，GAPDH 1：5000）、二抗（1：10000），ECL試劑和顯影儀圖像采集。用Image J 軟件測(cè)定光密度值分析E-Cadherin等蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 小管形成能力檢測(cè)將分裝的Matrigel膠在冰上用培基以1：3比例稀釋后以200μL/孔平鋪于24孔板內(nèi)，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中30 min后備用；HLECs制成細(xì)胞懸液，取三組含不同外泌體的細(xì)胞與培基混和，以1×105細(xì)胞/孔將細(xì)胞鋪于膠表面，然后繼續(xù)于培箱中培養(yǎng)6h，取出24孔板于顯微鏡下觀察HLECs成管情況并計(jì)數(shù)、拍照。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，多組間采用多因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)尋找和預(yù)測(cè)E-Cad（CDH1）上游miRNAs通過(guò)檢索生物信息學(xué)網(wǎng)站TargetScan（www.targetscan.org）和miRcode（www.mircode.org），發(fā)現(xiàn)了miR-217，miR-9-5p 和miR-338-3p可能是E-cad的上游microRNA。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 軟件預(yù)測(cè)E-cad（CDH1）上游miRNA

2.2 RT-qPCR 檢測(cè)淋巴結(jié)組織中miR-217，miR-9-5p 和miR-338-3p 含量圖2可見(jiàn)，LN+組的miR-9-5p 表達(dá)為6.2±1.2、miR-217表達(dá)為5.7±0.8、miR-338-3p 表達(dá)為3.5±1.1分別明顯高于與LN-組的 2.1±0.7、1.5±0.8、1.7±0.8（P<0.05）。發(fā)現(xiàn)miR-217 表達(dá)差異最大（見(jiàn)圖2）。

圖2 淋巴結(jié)組織中miRNA 表達(dá)情況

2.3 外泌體miR-217對(duì)Siha細(xì)胞侵襲能力的影響通過(guò)Transwell小室法檢測(cè)各組細(xì)胞外泌體對(duì)Siha 細(xì)胞侵襲能力的影響。通過(guò)對(duì)穿過(guò)小室濾過(guò)膜的穿膜細(xì)胞進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)外泌體miR-217 表達(dá)下調(diào)的Siha 細(xì)胞侵襲能力較其他兩組明顯下降?？瞻捉M、陰性對(duì)照組及LV-miR-217-siRNA 組通過(guò)對(duì)小室濾過(guò)膜上的穿膜細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量分別為328±43，369 ±62 和 139±16，LV-miR-217-siRNA 組的穿膜細(xì)胞數(shù)在三組中最少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示外泌體miR-217 表達(dá)下調(diào)的Siha 細(xì)胞侵襲力明顯減弱（見(jiàn)圖3）。

圖3 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各處理組細(xì)胞侵襲情況（結(jié)晶紫染色，×400 光學(xué)顯 微鏡）及統(tǒng)計(jì)

2.4 外泌體miR-217對(duì)淋巴管新生的誘導(dǎo)影響檢測(cè)三組細(xì)胞外泌體對(duì)人淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（HLECs）小管形成的影響?？瞻捉M、陰性對(duì)照組及LV-miR-217-siRNA 組細(xì)胞成管數(shù)量分別為43149 ± 401.3，44377 ± 284.4和 22144 ± 448.2。LV-miR-217-siRNA 組的細(xì)胞成管數(shù)量最少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示外泌體miR-217 表達(dá)下調(diào)會(huì)顯著降低HLECs成管能力。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 檢測(cè)各組細(xì)胞外泌體對(duì)人淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（HLEC）小管形成的影響及統(tǒng)計(jì)

2.5 外泌體miR-217對(duì)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中E-cad表達(dá)水平的影響WB檢測(cè)外泌體miR-217對(duì)人淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（HLECs）E-Cad表達(dá)的影響：三組細(xì)胞外泌體與HLECs共孵育48h，收集三組細(xì)胞并提取蛋白，WB檢測(cè)E-Cadherin表達(dá)?？瞻捉M、陰性對(duì)照組及LV-miR-217-siRNA 組E-Cadherin蛋白表達(dá)分別為0.5619±0.0033，0.561±0.0047和0.6078±0.0016。發(fā)現(xiàn)：LVmiR-217-siRNA 組E-Cadherin 表達(dá)明顯強(qiáng)于其它組，這提示外泌體miR-217 對(duì)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞E-Cadherin 蛋白表達(dá)是抑制的（見(jiàn)圖5）。

圖5 外泌體miR-217 對(duì)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞E-Cadherin 表達(dá)影響

3 討論

淋巴轉(zhuǎn)移是宮頸癌主要的轉(zhuǎn)移方式，但機(jī)制尚不明確。E-cad是上皮組織中細(xì)胞間粘附的關(guān)鍵介質(zhì)，我們前期已證實(shí)E-cad在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)低于正常宮頸組織［5］，宮頸癌細(xì)胞的粘附功能降低，侵襲力和遷移能力增加［7］。我們通過(guò)生物信息學(xué)檢索發(fā)現(xiàn)了miR-217，miR-9-5p 和miR-338-3p 可能是E-cad的上游miRNA，在陽(yáng)性淋巴結(jié)中，miR-217，miR-9-5p 和miR-338-3p表達(dá)明顯高于淋巴結(jié)陰性組，且miR-217表達(dá)差異最大［8-10］。miR-217是否通過(guò)E-cad調(diào)節(jié)宮頸癌轉(zhuǎn)移無(wú)報(bào)道。

外泌體是細(xì)胞主動(dòng)分泌的大小均一、直徑30～150nm 的囊泡樣小體，可攜帶包含miRNA在內(nèi)的多種物質(zhì)［11］，參與調(diào)節(jié)人體生理或病理過(guò)程。腫瘤來(lái)源的外泌體可以通過(guò)參與腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成，促進(jìn)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌Siha細(xì)胞分泌的外泌體miR-217對(duì)癌細(xì)胞的侵襲能力有影響，外泌體miR-217-siRNA可降低Siha 細(xì)胞的侵襲能力，能促進(jìn)Siha細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)LVmiR- 217-siRNA 組的細(xì)胞成管數(shù)量最少，證明外泌體miR-217表達(dá)下調(diào)會(huì)顯著降低HLECs成管能力。原發(fā)腫瘤周圍新生的淋巴管可將腫瘤細(xì)胞及其他生物分子快速輸送至區(qū)域淋巴結(jié)，最后造成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。我們的研究提示宮頸癌Siha細(xì)胞外泌體攜帶的miR-217能促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外泌體miR-217 抑制HLECs E-Cad蛋白表達(dá)。

綜上，我們的研究表明，癌源性外泌體miR-217能促進(jìn)宮頸癌Siha細(xì)胞淋巴管新生，其機(jī)制可能是通過(guò)miR-217抑制人淋巴內(nèi)皮細(xì)胞E-Cad蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。這對(duì)于揭示癌源性外泌體在宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移中的作用，了解宮頸癌的淋巴轉(zhuǎn)移機(jī)制有重要意義，也為干預(yù)和治療宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移提供了新思路。