于海明，周 煦，裴興華，盧 武，肖 彥，吳艷紅

（湖南省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，長沙 410005）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種以進(jìn)行性氣流受限和肺功能喪失為特點(diǎn)的慢性炎癥反應(yīng)性疾?。?］，是全球死因第三名的疾病。COPD常累及全身骨骼肌系統(tǒng)，尤其是呼吸肌，呼吸肌消耗及功能障礙引起的呼吸衰竭是COPD患者晚期死亡的最重要原因［2］。膈肌是最主要的呼吸肌，約占全部呼吸功能的60-80%［3］。肌肉生長抑制素（myostatin），又稱為生長分化因子8（GDF-8），是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）超家族成員，主要表達(dá)于骨骼肌，抑制肌肉的生長發(fā)育，參與骨骼肌的消耗和功能障礙［4］，在許多消耗性疾病或年齡增長所引起的肌肉萎縮中均發(fā)現(xiàn)myostatin增高［5］。COPD時(shí)同時(shí)存在膈肌萎縮和凋亡，但膈肌myostatin表達(dá)是否與膈肌凋亡萎縮相關(guān)尚不明確。本研究將通過單純熏香煙法復(fù)制大鼠COPD模型，檢測膈肌組織myostatin mRNA表達(dá)和凋亡萎縮情況，探討二者之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡雄性SD大鼠，體重200～250g，購于湖南斯萊克競答實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（湘）2015-0013。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑芙蓉牌香煙（焦油12mg/支）購自湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，瑞氏-姬姆薩染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，Trizol購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑購自Fermentas公司，原位細(xì)胞凋亡檢測（TUNEL）試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，引物序列由上海生工公司合成。

1.3 動(dòng)物分組和模型SD大鼠通過隨機(jī)數(shù)字法分為正常對(duì)照組（n=8）和COPD組（n=8）。COPD大鼠模型建立：采用單純熏香煙法制備COPD模型［6］，煙霧暴露箱（72.8cm×52.4cm×45.8cm）：由整理箱改裝而成，利用有機(jī)玻璃將箱體分隔2層，上2/3為煙霧暴露區(qū)，下1/3為燃煙區(qū)，箱蓋、箱底及隔面均有數(shù)個(gè)1cm×1cm大小的通氣孔。將大鼠放置入煙霧暴露箱中被動(dòng)吸煙，同時(shí)燃燒6支香煙（每間隔4周加1支香煙），20分鐘后香煙燃燒完全，煙霧消失后待大鼠休息5分鐘，再重復(fù)煙霧暴露一次。4小時(shí)后重復(fù)上述煙霧暴露。每天共煙霧暴露4次，連續(xù)20周。正常組大鼠每天放置入煙霧暴露箱，但不進(jìn)行煙霧暴露。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 大鼠一般情況觀察大鼠外觀、行為、活動(dòng)及對(duì)刺激的反應(yīng)。

1.4.2 支氣管肺泡灌洗液（BALF）細(xì)胞分類計(jì)數(shù)按照文獻(xiàn)報(bào)道方法收集BALF［7］，暴露氣管及雙肺，結(jié)扎右主支氣管，從氣管下1/3做倒T字切口后，用針頭插入左肺，向左肺緩慢灌注無菌生理鹽水3mL，再緩慢抽出，重復(fù)3次，所得溶液記為BALF。收集的BALF混勻后通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)器統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)；再通過瑞氏-姬姆薩染色作細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.4.3 大鼠體重、膈肌重量記錄造模前后大鼠體重和造模后大鼠膈肌重量。

1.4.4 膈肌凋亡指數(shù)通過TUNEL法檢測膈肌細(xì)胞凋亡，具體按說明書進(jìn)行操作。凋亡指數(shù)（AI）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4.5 肌肉生長抑制素mRNA表達(dá)通過Trizol法提取膈肌組織總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試產(chǎn)生cDNA，RTPCR檢測myostatin mRNA表達(dá)，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性阻塞性肺疾病大鼠一般情況造模前大鼠飲食正常、行動(dòng)敏捷、皮膚清潔有光澤；COPD造模后大鼠精神萎靡、飲食進(jìn)水減少、活動(dòng)遲緩、毛發(fā)黃澀，呼吸頻率加快，部分大鼠可見口鼻內(nèi)分泌物，或出現(xiàn)煩躁不安表現(xiàn)。

2.2 慢性阻塞性肺疾病大鼠BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)造模后，COPD組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值及百分比、巨噬細(xì)胞絕對(duì)值高于正常對(duì)照組（P<0.05），而巨噬細(xì)胞所占百分比降低（P<0.05），結(jié)果見表2。

表2 兩組大鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類比較

2.3 慢性阻塞性肺疾病大鼠體重和膈肌重量造模后，COPD組大鼠體重（446.82±30.69）g低于正常對(duì)照組（584.87±21.13）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其膈肌重量（1.31±0.16）g也低于正常對(duì)照組（1.726±0.073）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），結(jié)果見表3。

表3 兩組大鼠體重和膈肌重量比較

2.4 慢性阻塞性肺疾病大鼠膈肌凋亡指數(shù)正常對(duì)照組和COPD組膈肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）分別為（1.17±0.21）%和（15.46±1.53）%。COPD組膈肌細(xì)胞AI高于正常對(duì)照組（P<0.05），結(jié)果見表3。

2.5 慢性阻塞性肺疾病大鼠膈肌myostatin mRNA表達(dá)RT-PCR結(jié)果如圖1顯示，COPD組膈肌中myostatin mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組增加，將圖片進(jìn)行灰度值分析，正常對(duì)照組和COPD組myostatin mRNA表達(dá)的灰度值分別為0.37±0.11和0.86±0.12，COPD組高于正常對(duì)照組（P<0.05），結(jié)果見表4。

圖1 兩組大鼠膈肌myostatin mRNA表達(dá)

表4 兩組大鼠膈肌myostatin mRNA表達(dá)比較

2.6 慢性阻塞性肺疾病大鼠膈肌myostatin mRNA表達(dá)與膈肌重量和凋亡的相關(guān)性COPD組膈肌中myostatin mRNA表達(dá)與膈肌重量呈負(fù)相關(guān)（R2=0.784，r=-0.885，P<0.05），與膈肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均呈正相關(guān)（R2=0.748，r=0.865，P<0.05），見圖2。

圖2 COPD組膈肌myostatin mRNA表達(dá)與膈肌重量（A）和凋亡（B）的相關(guān)性

3 討論

COPD作為一種重要的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，由于其緩慢進(jìn)行性進(jìn)展，嚴(yán)重影響患者勞動(dòng)能力和生活質(zhì)量。近年來COPD的發(fā)病率和病死率仍在持續(xù)上升，它的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，并缺乏有效的治療手段，對(duì)于臨床醫(yī)務(wù)工作者是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。吸煙是COPD重要的致病因素之一［8］，吸煙者COPD的發(fā)生率明顯高于不吸煙者，戒煙是COPD治療策略中關(guān)鍵的措施之一［9］。吸煙產(chǎn)生的有害氣體或顆粒能引起異常的肺部炎癥反應(yīng)，主要通過損傷氣道上皮細(xì)胞并影響纖毛運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致支氣管杯狀細(xì)胞增生，黏液分泌增多使得凈化能力降低；吸煙還能抑制肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能，病原體更易于潴留于呼吸道內(nèi)而引起炎癥反應(yīng)。此外吸煙還能引起氧化應(yīng)激和蛋白酶-抗蛋白酶系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致肺氣腫的產(chǎn)生［10，11］。

在本研究中，我們通過5個(gè)月的長期煙霧暴露來復(fù)制COPD大鼠模型，接受煙霧暴露的大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、飲食進(jìn)水減少、活動(dòng)遲緩、毛發(fā)黃澀，呼吸頻率加快，后期部分大鼠可見口鼻內(nèi)分泌物，或出現(xiàn)煩躁不安等癥狀。造模后，COPD組大鼠體重明顯低于正常。肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯升高，表明氣道腔和肺部存在以中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞為主的炎癥反應(yīng)，這與Vlahos等的研究報(bào)道一致［12］。表明我們的研究中香煙煙霧吸入成功復(fù)制COPD模型。

研究表明，凋亡在COPD發(fā)生發(fā)展的病理生理學(xué)過程中發(fā)揮重要的作用［13，14］，骨骼肌凋亡使得肌肉質(zhì)量減少，從而引起肌肉萎縮。我們的研究表明，COPD大鼠的膈肌凋亡增加，質(zhì)量減少，這與既往報(bào)道相符［15］。由此可見，膈肌細(xì)胞凋亡參與了COPD的發(fā)病過程，但具體機(jī)制目前尚不明確。肌肉生長抑制素主要作用是抑制肌肉的生長發(fā)育，有研究發(fā)現(xiàn)其基因敲除小鼠表現(xiàn)出肌肉增生肥大，而轉(zhuǎn)基因小鼠則出現(xiàn)萎縮及惡病質(zhì)［16］。我們的研究表明肌肉生長抑制素mRNA表達(dá)在COPD時(shí)明顯升高。肌肉生長抑制素在正常時(shí)以無活性的形式存在，在缺氧、氧化損傷等情況下活化后高表達(dá)［17］，COPD時(shí)往往存在這些誘導(dǎo)肌肉生長抑制素高表達(dá)的危險(xiǎn)因素。相關(guān)分分析結(jié)果提示COPD時(shí)膈肌肌肉生長抑制素mRNA表達(dá)與膈肌重量呈負(fù)相關(guān)，而與膈肌細(xì)胞凋亡指數(shù)呈正相關(guān)。因此，我們推測肌肉生長抑制素的高表達(dá)可能與膈肌細(xì)胞凋亡和萎縮有關(guān)，從而導(dǎo)致膈肌功能障礙而引起呼吸衰竭，參與COPD的發(fā)病過程。在COPD早期抑制肌肉生長抑制素的表達(dá)可能是一個(gè)有前途的預(yù)防或治療COPD的措施。

綜上所述，我們通過單純熏香煙法成功建立了大鼠COPD模型，COPD大鼠膈肌肌肉生長抑制素mRNA表達(dá)增加，可能與促進(jìn)膈肌細(xì)胞凋亡及萎縮相關(guān)。進(jìn)一步探索肌肉生長抑制素在COPD中的作用和機(jī)制，能為COPD的防治提供新的靶點(diǎn)。