李軍瑞,鄺宇,黃田,馬忠明,梁新紅

（河南科技學院食品學院,河南新鄉(xiāng)453003）

麥芽糖漿是以優(yōu)質(zhì)淀粉為原料,經(jīng)過液化、糖化、脫色過濾、精制、濃縮而成的一種淀粉糖產(chǎn)品,其主要成分是麥芽糖[1-2].麥芽糖不參與胰島素代謝,具有較低的吸潮性和較高的保濕型,并且抗結(jié)晶性良好,能抑制食品脫水和淀粉老化,延長食品的貯藏期;另外,麥芽糖漿具有甜度適中和營養(yǎng)性高的特點,能較好代替熱能食品[3-4],因此,麥芽糖漿被廣泛應(yīng)用在食品和醫(yī)藥行業(yè).

目前,酶法工藝是國內(nèi)外麥芽糖漿主要采用的生產(chǎn)方式[5-6],酶法制備麥芽糖漿主要有液化酶和糖化酶,其中常見液化酶為α-淀粉酶[7-9],而β-淀粉酶為麥芽糖生產(chǎn)中最重要的糖化酶.目前,工業(yè)用β-淀粉酶(1,4-α-D-glucan maltohydrolase,E.C.3.2.1.2)大多都來源于甘薯、大麥等高等植物,甘薯β-淀粉酶和大麥β-淀粉酶在食品行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用[10].β-淀粉酶作為外切酶作用于淀粉,產(chǎn)物主要是麥芽糖和β-界限糊精,在食品工業(yè)中,玉米、甘薯、馬鈴薯和木薯淀粉等是很好生產(chǎn)麥芽糖的原料[11].甘薯β-淀粉酶轉(zhuǎn)化淀粉時,產(chǎn)物中的麥芽糖含量多,副產(chǎn)物少,在生產(chǎn)高純度麥芽糖或結(jié)晶麥芽糖方面具有很大優(yōu)勢[12].

作為一種活性蛋白,β-淀粉酶的催化效率極易受到生產(chǎn)環(huán)境的影響[13],導致麥芽糖含量下降,并且不利于高麥芽糖漿的生產(chǎn).目前酶分子化學修飾是提高酶的穩(wěn)定性、生物活性或者延長酶的半衰期的一種非常有效的手段,Tardioli等[14]將糖化酶中的羧基與乙二胺中的氨基經(jīng)過化學修飾進行胺化,胺化后的酶保留了良好的活性,而且胺化之后的酶性質(zhì)非常穩(wěn)定,其穩(wěn)定性比水溶性酶提高500倍以上.Xue等[15]利用酸酐基團對菠蘿蛋白酶進行修飾,增強了菠蘿蛋白酶的熱穩(wěn)定性和耐堿性.酶修飾技術(shù)在β-淀粉酶的研究上也有進一步的應(yīng)用,Daba等[16]用三硝基苯磺酸(TNBS)、mPEG、戊二醛(GA)對小麥β-淀粉酶進行修飾,結(jié)果表明,經(jīng)mPEG修飾后夠明顯提高酶的活力和熱穩(wěn)定性,但GA只能提高酶的熱穩(wěn)定性;TNBS可以提高酶的活力,但酶穩(wěn)定性明顯降低.本課題組已經(jīng)研究了甘薯β-淀粉酶經(jīng)甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺(Methoxy polyethylene glycol maleic amide,MPEG-Mal,MW:5000)修飾可以提高酶的催化效率和改善酶的特性,與未修飾甘薯β-淀粉酶比較,獲得的新型修飾甘薯β-淀粉酶酶活性由1.733×104U/mg提高至2.150×104U/mg,提高了(24.06±3.17)%,其熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性也明顯提高[17],但還未應(yīng)用到高麥芽糖漿的生產(chǎn)中.因此將新型修飾β-淀粉酶應(yīng)用于高麥芽糖漿的生產(chǎn),以期為新型修飾酶工業(yè)化應(yīng)用提供理論支持.

本文采用高效液相色譜對新型修飾β-淀粉酶酶解產(chǎn)物進行分析,研究添加量、酶解時間、酶解溫度及酶解pH對甘薯淀粉制備高麥芽糖漿時麥芽糖產(chǎn)量的影響,并應(yīng)用新型修飾β-淀粉酶對甘薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉和馬鈴薯淀粉進行酶解試驗.

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1原料與試劑 甘薯,河南科技學院甘薯試驗田;甘薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉和馬鈴薯淀粉,新鄉(xiāng)市華聯(lián)超市;耐高溫α-淀粉酶,鄭州市福源生物科技有限公司;甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺,Sigma-Aldrich公司;葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖,Sigma-Aldrich公司;乙腈,Sigma-Aldrich公司.

1.1.2主要儀器設(shè)備Waters 1525-2414高效液相色譜儀,高效液相色譜系統(tǒng)由Waters 1525 Binary HPLC Pump,Waters 2707自動進樣器,Waters 2414示差檢測器等組成,美國Water公司;Shodex Asahipak NH2P-50 4E色譜柱,日本Shodex公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 β-淀粉酶酶活測定方法β-淀粉酶酶活測定參考文獻[17].

1.2.2 甘薯β-淀粉酶分離純化 粗酶液的制備:參考文獻[18]的方法制備;β-淀粉酶分離純化:應(yīng)用AKTA purifierTM10蛋白質(zhì)純化儀,Mono Q陰離子交換層析柱和SuperdexTM75凝膠層析柱,檢測波長280 nm條件下進行分離純化,具體方法及步驟參考文獻[19].將出峰位置所對應(yīng)的收集管中的酶液分別收集,濃縮后冷凍干燥,4℃保存?zhèn)溆?

1.2.3 新型β-淀粉酶制備 新型修飾β-淀粉酶儲備液制備參考文獻[17]:準確稱量50 mg新型修飾β-淀粉酶溶到2.5 mL pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中4℃儲藏備用;新型修飾β-淀粉酶的制備:參考Liang等參考文獻[17]的方法.

1.2.4 高麥芽糖漿制備 以淀粉為原料,新型修飾β-淀粉酶酶解淀粉的工藝流程[1]為

按照淀粉與水的比例為1∶3.5～4.0調(diào)漿,調(diào)整淀粉漿溫度90～95℃,加入α-淀粉酶,酶添加量為5 U/g,淀粉漿迅速液化,將淀粉漿降溫至60℃,加入一定量的新型修飾β-淀粉酶,按照試驗設(shè)計保溫一定時間,結(jié)束糖化,即可獲得高麥芽糖漿.

1.2.5 新型修飾β-淀粉酶酶解溫度對麥芽糖產(chǎn)率的影響 參考梁新紅等[20]的方法,并稍作修改.加入高溫α-淀粉酶5 U/g,加入新型修飾β-淀粉酶120 U/g干淀粉,時間16 h,pH為6.0,研究新型修飾β-淀粉酶酶解溫度在35、40、45、50、55、60、65和70℃下對麥芽糖含量的影響.

1.2.6 新型修飾β-淀粉酶酶解pH對麥芽糖產(chǎn)率的影響 參考Liang等[17]的方法,并稍作修改.加入高溫α-淀粉酶5 U/g,酶解溫度為55℃,加入新型修飾β-淀粉酶120 U/g干淀粉,酶解16 h,研究酶解pH在4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0下麥芽糖含量的影響.

1.2.7 新型修飾β-淀粉酶添加量對麥芽糖產(chǎn)率的影響 依據(jù)方法1.2.3,加入5 U/g高溫α-淀粉酶,溫度55℃,酶解16 h,酶解pH 6.0,研究新型修飾β-淀粉酶添加量為0、30、60、90、120、150、180、210 U/g干淀粉時對麥芽糖含量的影響.

1.2.8 新型修飾β-淀粉酶酶解時間對麥芽糖產(chǎn)率的影響 依據(jù)方法1.2.4,加入高溫α-淀粉酶5 U/g,酶解溫度55℃,加入新型修飾β-淀粉酶120 U/g干淀粉,pH 6.0,研究新型修飾β-淀粉酶酶解時間為0、4、8、12、16、20、24 h時對麥芽糖含量的影響.

1.2.9 正交試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果進行正交試驗,對新型修飾β-淀粉酶酶解條件進行優(yōu)化,設(shè)計酶解溫度、酶解pH、酶添加量及酶解時間對酶解甘薯淀粉的麥芽糖含量影響的正交試驗優(yōu)化.

1.3 分析方法

HPLC法測定酶解產(chǎn)物中糖含量[21]:分別稱取0.1 g的葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖,用流動相(70%的乙腈)定容,得到4種糖質(zhì)量濃度均為5.0 mg/mL的混合糖標準溶液,在4℃下保存.使用流動相將100μL高麥芽糖漿進行稀釋,柱溫箱內(nèi)外部溫度分別為35℃、30℃.流動相為70%乙腈,經(jīng)0.45μm濾膜過濾,超聲脫氣15 min,流速為1 mL/min,進樣體積為20μL,用外標法定量檢測4種標準溶液的糖含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 新型修飾β-淀粉酶酶解可溶性淀粉產(chǎn)物的HPLC分析

依據(jù)方法1.3,在色譜分析條件下,采用HPLC對糖標準樣品和新型修飾β-淀粉酶酶解產(chǎn)物進行分析,結(jié)果如圖1和圖2所示.

圖1 糖標準樣品的HPLC圖譜Fig.1 HPLCspectrum of standard saccharides

圖2 新型修飾β-淀粉酶酶解可溶性淀粉產(chǎn)物的HPLC圖譜Fig.2 HPLC spectrum of soluble starch hydrolysates by novel modifiedβ-amylase

由圖2可知,新型修飾β-淀粉酶酶解可溶性淀粉酶解產(chǎn)物色譜圖中出現(xiàn)4個吸收峰,與圖1標準樣品色譜圖對比分析,得到新型修飾β-淀粉酶酶解淀粉產(chǎn)物的峰保留時間與糖標準品峰保留時間基本一致.采用HPLC外標法計算酶解產(chǎn)物中糖的含量,結(jié)果見表1.

表1 新型修飾β-淀粉酶酶解可溶性淀粉產(chǎn)物分析Tab.2 Analysis of hydrolysates of soluble starch by novel modifiedβ-amylase %

由表1可知,新型修飾β-淀粉酶酶解可溶性淀粉產(chǎn)物中低聚糖主要為麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、葡萄糖及其他聚合度糊精,其中麥芽糖質(zhì)量分數(shù)高達(83.51±4.38)%,聚合度5以上的糊精僅為(4.53±0.17)%.研究結(jié)果與陳松玲等[21]對β-淀粉酶酶解甘薯淀粉、小麥淀粉、玉米淀粉和馬鈴薯淀粉等酶解產(chǎn)物中糖量測定結(jié)果相近.

2.2 新型修飾β-淀粉酶酶解淀粉制備高麥芽糖漿單因素試驗研究

2.2.1 新型修飾β-淀粉酶酶解溫度對麥芽糖產(chǎn)率的影響 依據(jù)方法1.2.5,研究新型修飾β-淀粉酶酶解溫度對甘薯淀粉酶解產(chǎn)物中麥芽糖含量的影響,結(jié)果如圖3所示.

圖3 新型修飾β-淀粉酶酶解溫度對麥芽糖產(chǎn)率的影響Fig.3 Effects of enzymatic hydrolysis temperature of novel modifiedβ-amylase on maltose yield

由圖3可知,隨著新型修飾β-淀粉酶酶解溫度的升高,麥芽糖含量不斷增加,當新型修飾β-淀粉酶酶解溫度在55℃時,麥芽糖質(zhì)量分數(shù)達到最大值(86.92±2.93)%;當新型修飾β-淀粉酶酶解溫度繼續(xù)升高時,麥芽糖含量顯著降低,酶解溫度達70℃時,麥芽糖質(zhì)量分數(shù)僅為(42.56±1.68)%.因此,新型修飾β-淀粉酶的最佳溫度為55℃.

2.2.2 新型修飾β-淀粉酶酶解pH對麥芽糖產(chǎn)率的影響 依據(jù)方法1.2.6,研究新型修飾β-淀粉酶酶解pH對甘薯淀粉酶解產(chǎn)物中麥芽糖含量的影響,結(jié)果如圖4所示.

圖4 新型修飾β-淀粉酶酶解pH對麥芽糖產(chǎn)率的影響Fig.4 Effects of enzymatic hydrolysis pH of novel modifiedβ-amylase on maltose yield

由圖4可知,隨著新型修飾β-淀粉酶酶解pH的升高,麥芽糖含量逐漸增加,當新型修飾β-淀粉酶酶解pH在6.0時,麥芽糖質(zhì)量分數(shù)達到最大值(88.36±3.15)%;隨著新型修飾β-淀粉酶酶解pH繼續(xù)升高,麥芽糖含量逐漸降低,當酶解pH升至8.0時,麥芽糖質(zhì)量分數(shù)僅為(27.62±1.14)%.因此,新型修飾β-淀粉酶的最佳pH為6.0.

2.2.3 新型修飾β-淀粉酶添加量對麥芽糖產(chǎn)率的影響 依據(jù)方法1.2.7,研究新型修飾β-淀粉酶添加量對甘薯淀粉酶解產(chǎn)物中麥芽糖含量的影響,結(jié)果如圖5所示.

圖5 新型修飾β-淀粉酶添加量對麥芽糖產(chǎn)率的影響Fig.5 Effects of amylase addition of novel modifiedβ-amylase on maltose yield

由圖5可知,新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉,添加量在0～120 U/g時,隨著新型修飾β-淀粉酶添加量的增加,酶解產(chǎn)物中麥芽糖的質(zhì)量分數(shù)從(14.33±0.85)%增加到(85.73±3.03)%,新型修飾β-淀粉酶添加量大于120 U/g時,酶解產(chǎn)物麥芽糖含量沒有顯著性差異(P＜0.05).因此,新型修飾β-淀粉酶的最佳加酶量為120 U/g.

2.2.4 新型修飾β-淀粉酶酶解時間對麥芽糖產(chǎn)率的影響 依據(jù)方法1.2.8,考察新型修飾β-淀粉酶酶解時間對甘薯淀粉酶解產(chǎn)物中麥芽糖含量的影響,結(jié)果如圖6.

圖6 新型修飾β-淀粉酶酶解時間對麥芽糖產(chǎn)率的影響Fig.6 Effects of enzymatic hydrolysis time of novel modifiedβ-amylase on maltose yield

由圖6可知,新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉,酶解時間在0～16 h時,麥芽糖質(zhì)量分數(shù)從(14.33±0.85)%增至(86.17±2.56)%,繼續(xù)增加新型修飾β-淀粉酶酶解時間,麥芽糖質(zhì)量分數(shù)沒有明顯變化.根據(jù)方差顯著性分析,新型修飾β-淀粉酶酶解時間在16～28 h時麥芽糖質(zhì)量分數(shù)沒有顯著性差異(P＜0.05).因此,新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉的最佳時間為16 h.

2.3 正交試驗結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果進行正交試驗,采用正交試驗設(shè)計考察新型修飾β-淀粉酶酶解溫度、酶解pH、酶添加量及酶解時間四種因素對甘薯淀粉水解效果的影響,以麥芽糖含量為指標,新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉試驗設(shè)計見表2.

表2 新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉因素水平表Tab.1 The level table of starch factors in enzymatic hydrolysis of sweet potato by novel modifiedβ-amylase

正交試驗結(jié)果及分析見表3.

表3 新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉正交試驗結(jié)果分析Tab.3 Analysis of orthogonal experiment results of enzymatic hydrolysis of sweet potato starch with novel modifiedβ-amylase

由表3分析可知,影響麥芽糖含量因素的主次順序為:B＞A＞C＞D,即新型修飾β-淀粉酶的酶解pH＞酶解溫度＞酶添加量＞酶解時間.根據(jù)正交試驗結(jié)果,酶解pH對麥芽糖含量的影響最大,酶解時間對麥芽糖含量的影響最小.因素最佳組合為A2B2C3D2,即新型修飾β-淀粉酶酶解pH為6.0,酶解溫度為55℃,加酶量為150 U/g,酶解時間為16 h.對新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉正交試驗結(jié)果進行進一步方差分析,結(jié)果見表4.

表4 新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉正交試驗結(jié)果方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal experiment results of enzymatic hydrolysis of sweet potato starch by novel modifiedβ-amylase

由表4可知,新型修飾β-淀粉酶酶解溫度、酶解pH及酶添加量對麥芽糖含量有顯著性差異,表明這三個因素對麥芽糖含量影響較大.

綜上所述,新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉最佳參數(shù):酶解pH為6.0,酶解溫度為55℃,加酶量為150 U/g,酶解時間為16 h.

2.4 驗證試驗

按照上述試驗得到的最佳參數(shù),平行進行三次試驗,測得麥芽糖質(zhì)量分數(shù)分別為(89.02±3.23)%,(89.11±3.34)%,(88.98±3.29)%,3次測得的平均值為(89.04±3.29)%.表明該參數(shù)可行.

2.5 新型修飾β-淀粉酶和甘薯β-淀粉酶酶解酶解淀粉效果比較

為對比新型修飾酶的酶解效果,分別應(yīng)用新型修飾β-淀粉酶和未修飾的甘薯β-淀粉酶酶解甘薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉制備高麥芽糖漿.酶解條件為:高溫α-淀粉酶添加量5 U/g,酶解溫度55℃,酶解pH 6.0,新型修飾β-淀粉酶和甘薯β-淀粉酶添加量均為150 U/g,酶解時間均為16 h.酶解產(chǎn)物中麥芽糖含量測定結(jié)果見表5.

表5 新型修飾β-淀粉酶和甘薯β-淀粉酶酶解淀粉產(chǎn)生麥芽糖含量比較Tab.5 Comparison of maltose content produced by enzymatic hydrolysis of starch by novel modifiedβ-amylase and sweet potato β-amylase

由表5可知,應(yīng)用新型修飾β-淀粉酶和未修飾甘薯β-淀粉酶在相同條件下分別酶解甘薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉和馬鈴薯淀粉,新型修飾β-淀粉酶的酶解效率均顯著高于未修飾甘薯β-淀粉酶(P＜0.05).梁新紅等[20]研究了甘薯β-淀粉酶酶解甘薯淀粉條件,即加酶量200 U/g,酶解時間28 h時,酶解產(chǎn)物中麥芽糖質(zhì)量分數(shù)(73.29±5.22)%,本研究中將新型修飾β-淀粉酶應(yīng)用于甘薯淀粉酶解,酶添加量減少了50 U/g,酶解時間縮短了12 h,但麥芽糖含量提升了17.69%;同時,梁新紅等[20]在應(yīng)用甘薯β-淀粉酶和新型修飾β-淀粉酶酶解玉米淀粉時也獲得了類似的結(jié)果.因此,應(yīng)用新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉,不僅減少了酶的用量,提高了酶解效率,而且提高了酶解產(chǎn)物中麥芽糖含量.

同時,由表5也可以看出,新型修飾β-淀粉酶對甘薯淀粉和小麥淀粉的酶解效率高于玉米淀粉和馬鈴薯淀粉,這可能與不同植物淀粉的聚合度和結(jié)晶度不同有關(guān),其機理有待于進一步探究.

3 結(jié)論

新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉時,酶解產(chǎn)物中的糖主要為麥芽糖,其質(zhì)量分數(shù)達80%以上.通過單因素和正交試驗可知,新型修飾β-淀粉酶酶解淀粉最優(yōu)參數(shù)為:酶解pH 6.0,酶解溫度55℃,酶添加量150 U/g,酶解時間16 h.在最佳酶解條件下,新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉的麥芽糖質(zhì)量分數(shù)為(89.04±3.29)%,與未修飾酶相比,麥芽糖含量提高了31.21%.應(yīng)用新型修飾酶生產(chǎn)高麥芽糖漿,減少了酶的用量,降低了生產(chǎn)成本,提高了酶解效率,為工業(yè)化提高麥芽糖漿生產(chǎn)效率及降低成本提供理論及實踐依據(jù).