楊祥，徐長(zhǎng)征，陳金華，孟勝利，王澤鋆，申碩，陳曉琦

1.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司病毒性疫苗研究一室，湖北武漢430207；2.國(guó)家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430207

手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）是一種由多種人腸道病毒（human enteroviruses，HEVs）引起的急性傳染疾病，多發(fā)于5歲以下兒童。臨床癥狀表現(xiàn)為手、足、口、臀等部位出疹及發(fā)熱等多種臨床癥狀。2008年5月2日，HFMD被納入《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定的丙類(lèi)傳染病進(jìn)行管理。在中國(guó)，2012年前引起HFMD的主要病原為腸道病毒71型（enterovirus A71，EV-A71）和柯薩奇病毒A組16型（Coxsackievirus A16，CV-A16）［1-4］。近年來(lái)，柯薩奇病毒A組6型（Coxsackievirus A6，CV-A6）、柯薩奇病毒A組10型（Coxsackievirus A10，CV-A10）等病原導(dǎo)致的HFMD在印度、東亞、日本、歐洲等地持續(xù)增加［4-9］，已成為HFMD的主要病原，為HFMD的防控帶來(lái)更大的挑戰(zhàn)。本研究以武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn)的EV-A71疫苗Ⅳ期臨床研究為基礎(chǔ)，分析EV-A71疫苗干預(yù)后，HFMD相關(guān)腸道病毒病原譜的變化及分子流行病學(xué)特征，為HFMD的預(yù)防及多價(jià)HFMD疫苗的研發(fā)和臨床研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 采集湖北省潛江市2019年5—12月，谷城縣2019年6—12月診斷為HFMD的患兒肛拭子樣本，于-80℃保存待檢。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《手足口病診療指南》（2018年版）。

1.2 主要試劑及儀器 核酸提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；EV-A71型 ／CV-A16型／CV-A10特異性及腸道病毒通用型RNA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碩世生物科技股份有限公司；Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit和TaKaRa LA Taq購(gòu)自寶日醫(yī)生物工程（北京）有限公司；ABI7500型熒光定量PCR儀和梯度PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3 病毒R N A的提取 用核酸提取試劑盒提取樣本RNA，-80℃保存待用。

1.4 腸道病毒型別鑒定 提取的RNA用EV-A71型／CV-A16型／CV-A10特異性及腸道病毒通用型RNA檢測(cè)試劑盒，通過(guò)ABI7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 腸道病毒V P1區(qū)部分基因序列擴(kuò)增 使用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit，以腸道病毒陽(yáng)性樣品RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)參考文獻(xiàn)［10］合成引物（表1），對(duì)VP1區(qū)部分基因進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃熱啟動(dòng)5 min；95℃變性30 s，42℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。產(chǎn)物于-20℃保存。

表1 基于VP1區(qū)段腸道病毒分型鑒定通用引物Tab.1 Primers used for typing and characterization of VP1 region of enterovirus

1.6 序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將陽(yáng)性產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行比對(duì)，確定病原的型別。再用DNAStar 7.0軟件對(duì)參考株和流行株進(jìn)行核苷酸序列同源性分析，根據(jù)參考文獻(xiàn)［11-19］，選取國(guó)內(nèi)外CV-A6、CV-A10、CV-A16、CV-A5各基因型和基因亞型的代表參考株與2019年谷城縣和潛江市兩地的代表流行株，使用MEGA 6.0軟件通過(guò)鄰接法（neighbor-joining，NJ），p-distance模型構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)1 000 Bootstrap評(píng)估建樹(shù)的可靠性，節(jié)點(diǎn)上顯示70%以上的Bootstrap值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 23.0，采用卡方檢驗(yàn)對(duì)標(biāo)本的陽(yáng)性檢出率進(jìn)行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HF MD相關(guān)腸道病毒病原譜 共采集HFMD標(biāo)本520份（谷城縣259份，潛江市261份），其中檢出腸道病毒陽(yáng)性樣本490份，檢出陽(yáng)性率為94.23%。谷城縣男性患兒陽(yáng)性率為93.80%（121／129），女性患兒陽(yáng)性率為93.08%（121／130），兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.007，P＞0.05）；潛江市男性患兒陽(yáng)性率為97.45%（153／157），女性患兒陽(yáng)性率為91.35%（95／104），兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.647，P＞0.05）。在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果為腸道病毒陽(yáng)性樣品中，共定型487份。其中谷城縣檢出腸道病毒陽(yáng)性樣本242份，共檢出6種腸道病毒，構(gòu)成比分別為CV-A6 84.30%（204／242）、A16 2.48%（6／242）、A10 7.44%（18／242）、A5 3.31%（8／242）、A4 0.83%（2／242）、A8 0.41%（1／242）、其他未定型的腸道病毒（other enterovirus，Other HEV）1.24%（3／242）；潛江市檢出腸道病毒陽(yáng)性樣本248份（含2份CV-A6、A10共感染），共檢出4種腸道病毒，構(gòu)成比分別為CV-A6 54.80%（137／250）、A16 40.4%（101／250）、A5 4.40%（11／250）、A8 0.40%（1／250）。見(jiàn)圖1。

圖1 谷城縣2019年6—12月（A）、潛江市2019年5—12月（B）腸道病毒陽(yáng)性樣本各病原構(gòu)成比Fig.1 Constituent ratios of pathogens in enteroviruses positive samples in Gucheng County from June to December 2019（A）and in Qianjiang City from May to December 2019（B）

2.2 時(shí)間和年齡分布 谷城縣和潛江市兩地區(qū)2019年下半年HFMD的流行各有特點(diǎn)，在流行時(shí)間上：谷城縣HFMD病例各月分布較分散，9—11月出現(xiàn)1個(gè)高峰，而潛江市HFMD病例在時(shí)間分布上較為集中，集中在5—8月，見(jiàn)圖2。在年齡分布上：谷城縣和潛江市兩地區(qū)主要發(fā)病人群為5歲以下兒童，占比分別達(dá)100%和98.08%，其中以1~2歲年齡組占比最高，分別為68.73%和3.68%，見(jiàn)圖3。

圖2 谷城縣2019年6—12月（A）和潛江市2019年5—12月（B）HFMD病例月分布Fig.2 Monthly distribution of cases of HFMD in Gucheng County from June to December 2019（A）and in Qianjiang City from May to December 2019（B）

圖3 谷城縣2019年6—12月和潛江市2019年5—12月HFMD患兒年齡分布Fig.3 Age distribution of children with HFMD in Gucheng County from June to December 2019 and in Qianjiang City from May to December 2019

2.3 分子進(jìn)化分析 進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖4，VP1區(qū)核苷酸和氨基酸同源性見(jiàn)表2。結(jié)果表明，谷城縣、潛江市兩地區(qū)的CV-A6流行株均屬于D3亞型；谷城縣的CVA10流行株屬于C亞型；谷城縣的CV-A16流行株屬于B1a亞型，而潛江市的CV-A16流行株屬于B1b亞型；兩地區(qū)的CV-A5流行株與2016年澳大利亞參考株MH111030最為接近。

表2 4種主要病原CV-A6、CV-A10、CV-A16、CV-A5基于部分VP1區(qū)同源性分析Tab.2 Homology of partial VP regions of four main pathogens CV-A6，CV-A10，CV-A16 and CV-A5

圖4 CV-A6（A）、CV-A10（B）、CV-A16（C）、CV-A5（D）部分VP1區(qū)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on partial VP1 regions of CV-A6（A），CV-A10（B），CV-A16（C）and CV-A5（D）

續(xù)圖4 CV-A6（A）、CV-A10（B）、CV-A16（C）、CV-A5（D）部分VP1區(qū)進(jìn)化樹(shù)Fig.4（Continued）Phylogenetic tree based on partial VP1 regions of CV-A6（A），CV-A10（B），CV-A16（C）and CV-A5（D）

3 討論

自2008年HFMD被列為我國(guó)法定丙類(lèi)傳染病以來(lái)，截止2018年累計(jì)報(bào)告HFMD病例2 000多萬(wàn)例，死亡3 670例，其中大部分重癥和死亡病例由EV-A71引起［18］，嚴(yán)重威脅著我國(guó)嬰幼兒的生命健康。2016、2017年，國(guó)內(nèi)3家公司的EV-A71疫苗相繼上市，HFMD相關(guān)重癥和死亡病例明顯減少。為了解疫苗干預(yù)后HFMD的病原譜特征，本研究以武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn)的EV-A71疫苗Ⅳ期臨床試驗(yàn)為基礎(chǔ)，分析接種地區(qū)HFMD腸道病毒病原譜及分子流行病學(xué)特征。共收集谷城縣2019年6—12月和潛江市2019年5—12月兩地區(qū)疑似HFMD標(biāo)本520份，未發(fā)現(xiàn)重癥和死亡病例，檢出腸道病毒陽(yáng)性樣本490份，陽(yáng)性率94.23%。共檢出6種不同型別的腸道病毒，未發(fā)現(xiàn)由EV-A71引起的HFMD，表明EV-A71疫苗對(duì)接種者產(chǎn)生了很好的保護(hù)效果。

在本次HFMD相關(guān)病原譜研究中，CV-A6在谷城縣、潛江市兩地區(qū)病原構(gòu)成比中均占比最高，分別達(dá)84.30%和54.80%，超過(guò)其他所有病原之和，是引起HFMD的主要病原。而目前已上市的單價(jià)EVA71疫苗對(duì)其他血清型腸道病毒引起的HFMD無(wú)交叉保護(hù)作用［20］，因此，加快包含CV-A6組分的多價(jià)HFMD疫苗研發(fā)，是目前防控HFMD的重要手段。根據(jù)參考文獻(xiàn)［11，20］，CV-A6在我國(guó)的流行可分為3個(gè)階段：第1階段是2009年以前，病例散發(fā)，以D2亞型為主；從2009—2012年為第2階段，CV-A6開(kāi)始在廣東等地區(qū)小規(guī)模暴發(fā)，此時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)D3亞型，該階段為D2、D3亞型共流行；2013年以后，CV-A6引起的HFMD大規(guī)模暴發(fā)，此時(shí)流行的CV-A6以D3亞型為主。本研究結(jié)果顯示，谷城縣、潛江市兩地區(qū)的CV-A6均為D3亞型，與我國(guó)目前CV-A6的流行現(xiàn)狀一致。這可能與D3亞型毒株的毒力和傳播能力有關(guān)，盡管其分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，但對(duì)今后的疫苗研究及疾病防控具有重要意義。

此外，谷城縣、潛江市兩地區(qū)在HFMD病原構(gòu)成譜上具有明顯差異，CV-A16在潛江市HFMD病原構(gòu)成中占比第2位，達(dá)40.4%，而CV-A16在谷城縣HFMD病原構(gòu)成中占比較低，僅為2.48%。通過(guò)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建和分析顯示，兩地區(qū)流行的CV-A16屬于不同亞型，潛江市流行株均屬于B1b亞型，谷城縣流行株均屬于B1a亞型。兩地區(qū)流行的CV-A16亞型不同，在病原構(gòu)成譜中占比差異明顯，推測(cè)兩地區(qū)CV-A16流行株的傳播能力不同，B1b亞型的傳播能力強(qiáng)于B1a亞型。

谷城縣病原構(gòu)成中占比第2位的是CV-A10（7.44%），通過(guò)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建和分析顯示，谷城縣流行的CV-A10為C亞型，與近年來(lái)國(guó)內(nèi)CV-A10流行株的亞型一致。而潛江市未發(fā)現(xiàn)由CV-A10引起的HFMD，可能是由于潛江市嬰幼兒體內(nèi)存在抗CVA10母?jìng)骺贵w的比例較高［21］。因此，對(duì)于由多種病原引起的HFMD的防控，僅依靠單價(jià)疫苗很難大幅度降低其發(fā)病率，研發(fā)多價(jià)HFMD疫苗是預(yù)防HFMD最有效的手段。另外需要關(guān)注的是，CV-A5在兩地區(qū)的病原構(gòu)成中均占據(jù)第3位，分別為谷城縣3.31%、潛江市4.40%，有進(jìn)一步成為優(yōu)勢(shì)病原體的趨勢(shì)，而目前關(guān)于該病毒的相關(guān)研究較少，因此需增加對(duì)CVA5的相關(guān)研究，以便更準(zhǔn)確地預(yù)防與診斷由CV-A5引起的疾病。

綜上所述，2019年EV-A71疫苗在湖北潛江市和谷城縣兩地區(qū)接種后，均未發(fā)現(xiàn)由EV-A71引起的HFMD，表明EV-A71疫苗對(duì)接種者產(chǎn)生了良好的保護(hù)效果。EV-A71疫苗接種后，兩地區(qū)病原構(gòu)成均以CV-A6為主，其他病原中CV-A10和CV-A5分別占據(jù)一定比例，潛江市CV-A16占比較高。通過(guò)對(duì)EV-A71疫苗干預(yù)后HFMD相關(guān)腸道病毒病原譜研究及主要病原VP1序列的分子進(jìn)化分析，為HFMD的預(yù)防及多價(jià)HFMD疫苗的研發(fā)提供了數(shù)據(jù)支持。