許木果，徐通，楊樸麗，徐榮

（云南省熱帶作物科學研究所，云南西雙版納666100）

諾麗果（noni）是一種包含多種營養(yǎng)成分，原產于夏威夷和大溪地島嶼上的熱帶植物。幾千年來人們將其莖、根、皮、葉和果實作為藥物治療多種疾病，包括糖尿病、高血壓和癌癥等[1-2]。我國引種于海南，現(xiàn)主要分布于云南、廣東、廣西、臺灣等地[3]。諾麗果含有多種氨基酸、維生素、微量元素及其它營養(yǎng)成分[4]，相關研究表明，諾麗果不僅具有明顯的抗菌消炎作用[5-6]，而且對于腫瘤細胞的生長具有明顯的抑制效果，具有預防和治療癌癥的作用[7-8]。張偉敏等[9-10]對諾麗果主要功能性物質的營養(yǎng)評價結果表明，諾麗果含有豐富的氨基酸及微量元素，與16種常見的熱帶水果相比其氨基酸的總量排名第一，具有較好的開發(fā)潛力和營養(yǎng)價值。林衛(wèi)華等[11]的研究結果表明，將不同劑量的諾麗果粉灌胃給予小鼠30 d后，小鼠游泳耐力顯著提高，增強了小鼠的運動機能。李奕星等[12]和胡鳴旭等[13]對諾麗果的抗氧化性研究結果表明，諾麗果汁中活性成分對自由基和過氧化氫具有很好的清除活性；諾麗果提取物可保護心肌細胞，調節(jié)受損心肌細胞能量代謝。相關文獻[14-17]對諾麗果主要化學性成分也進行了測定分析，分離鑒定出了大量化合物及有效成分。

綜合以上研究結果，諾麗果具有多種有效功能性成分，具有較好的開發(fā)應用前景，但目前對諾麗果的研究主要集中在其藥理作用和對相關化學成分的分析鑒定上，對諾麗果有效營養(yǎng)成分的提取純化及應用方面的研究報道較少；由于諾麗果中含有大量人體所必需的氨基酸[10]，而生物堿大多屬氨基酸衍生物，因此本試驗選取諾麗果生物堿為研究對象，利用超聲法對其提取條件進行研究，以期獲得簡單有效的諾麗生物堿提取方法，為其功能性成分的利用和研究提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

諾麗果：采自西雙版納州景洪市。采集正常生長且成熟度一致的諾麗鮮果進行處理，經洗凈、烘干、研磨成粉，分別過 20、40、60、80、100、120 目篩。諾麗生物堿對照品：中國藥品生物制品檢定所；鹽酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、溴麝香草酚藍、乙醇、氯仿：國藥集團有限公司，均為分析純。

1.2 儀器設備

MS104TS/00電子天平、SevenExcellence PH計：梅特勒-托利多有限公司；UV-2700紫外分光光度計：日本島津公司；N-2110旋轉蒸發(fā)儀：日本東京理化器械株式會社；101-2AB電熱鼓風干燥：天津泰斯特儀器有限公司；SHZ-D循環(huán)水多用真空泵：鄭州英峪領科儀器設備有限公司；KQ-600DB超聲波提取器：昆山舒美超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試劑的配制

0.5%鹽酸：量取25 mL濃鹽酸加入500 mL蒸餾水中，轉移至1 000 mL容量瓶，定容至刻度。

pH7.0緩沖溶液：稱取磷酸二氫鉀6.8 g，加入0.1mol/L的氫氧化鈉溶液291mL，用水稀釋至1000mL。

4 mol/L氫氧化鈉：稱取160 g氫氧化鈉加蒸餾水溶解定容至1 000 mL，轉移到塑料瓶中保存。

酸性染料：精確稱取溴麝香草酚藍0.125 0 g，置于1 000 mL容量瓶中，用pH7.0的緩沖溶液溶解定容至刻度線。

1.3.2 諾麗果生物堿的提取及分離

稱取5.0 g諾麗果粉，加入一定濃度的乙醇溶液，按照所設定條件進行超聲輔助提取。將提取液進行多次回收抽濾，至濾出的雜質中無乙醇味。濾液用旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮后，加入足量0.5%的鹽酸溶解，反應后的生成物溶解于水中，同時伴有部分類似于樹脂狀的物質析出。將溶液過濾，濾液用4 mol/L氫氧化鈉調節(jié)至pH值為10左右，使諾麗果生物堿以游離的狀態(tài)沉淀出來，用氯仿萃取3次，合并萃取液并用旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，將濃縮物轉移定容至25 mL容量瓶中。

1.3.3 單因素試驗

分別設置不同的乙醇濃度、提取時間、提取溫度、液料比、超聲功率提取諾麗果生物堿，分析不同單因素提取條件對諾麗果生物堿得率的影響。

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗設計基礎上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，選取與諾麗果生物堿得率具有較強交互作用的提取時間、液料比、超聲功率3個因素作為自變量，諾麗生物堿的得率作為響應值，設計三因素三水平的響應面分析試驗。共設計17個試驗，其中12個為析因試驗，5個為中心試驗，用來估算試驗誤差，試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗設計Table 1 Variables and levels in central composite design

1.3.5 最大吸收波長的確定

吸取1.3.2所得提取液5 mL，加入50 mL容量瓶中，用氯仿稀釋定容作為諾麗生物堿待測液。吸取溶液1 mL，加入5 mL氯仿及6 mL的溴麝香草酚藍酸性染料，于分液漏斗中搖動后，靜置分層。取氯仿層，用優(yōu)級脫脂棉過濾后，吸取4.0 mL，加入無水硫酸鈉0.2 g，搖勻，以氯仿作為空白。在紫外分光光度計上，于量程范圍進行掃描，分析掃描曲線結果，確定諾麗果生物堿的最大吸收峰波長為418 nm。

1.3.6 標準溶液的制備

精確稱取36 mg諾麗生物堿對照品，置于25 mL容量瓶中，加氯仿溶液并稀釋定容至刻度，搖勻。精密量取5 mL以上溶液于50 mL容量瓶中，加氯仿稀釋至刻度即得濃度為144μg/mL諾麗果生物堿對照品溶液。

用玻璃移液管量取對照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別加入25 mL具塞刻度試管中，準確補充加入氯仿至1 mL。加入5 mL氯仿及6 mL的溴麝香草酚藍溶液，按照1.3.5步驟進行染色處理，以未加生物堿的氯仿溶液作為對照，測定吸光度。以諾麗生物堿濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得標準曲線方程為：A=0.034 5C+0.077 4，R2=0.999 8，諾麗生物堿標準曲線見圖1。

圖1 諾麗果生物堿標準曲線Fig.1 Standard curve of noni alkaloids

1.3.7 生物堿得率計算

將諾麗果生物堿待測液按1.3.5步驟進行染色處理，于418 nm波長條件下測得吸光度值，帶入標準曲線得出待測液中生物堿濃度后，計算生物堿得率，具體公式如下。

式中：W為生物堿得率，g/kg；C為上機液濃度，mg/mL；D為稀釋倍數(shù)；V為溶液體積，mL；m為樣品質量，mg。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.0和Design Expert 12.0對所得試驗數(shù)據(jù)進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對生物堿得率的影響

乙醇濃度對諾麗果生物堿得率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對諾麗果生物堿得率的影響Fig.2 Effect of different ethanol concentration on the extraction rate of alkaloids

由圖2可知，當乙醇濃度小于70%時，諾麗果生物堿的得率逐漸增加，當乙醇濃度達到70%以后，開始呈現(xiàn)下降的趨勢。分析原因，可能是當乙醇濃度增大時，樣品中脂溶性物質和糖類等成分的析出量增多，對諾麗果生物堿的提取效果產生影響。因此，選取乙醇濃度70%的溶液作為諾麗果生物堿的提取劑。

2.1.2 顆粒度對生物堿得率的影響

顆粒度對諾麗果生物堿得率的影響見圖3。

圖3 顆粒度對諾麗果生物堿得率的影響Fig.3 Effect of mesh number on the extraction rate of alkaloids

由圖3可知，在20目～60目之間，隨著目數(shù)的增加，諾麗果生物堿得率呈現(xiàn)增加的趨勢，當超過60目時生物堿的得率出現(xiàn)降低趨勢。原因可能是隨著目數(shù)的增加，諾麗果粉顆粒變小，擴散時間縮短，且與溶劑的接觸面積相對較大，得率提高；但當粉碎粒度過細時，會增加諾麗果樣品的表面流動阻力，樣品顆粒在乙醇溶液中的擴散速度變慢，導致生物堿的得率下降。故選取60目作為諾麗果生物堿的顆粒度。

2.1.3 提取時間對生物堿得率的影響

提取時間對諾麗果生物堿得率的影響見圖4。

圖4 提取時間對諾麗果生物堿得率的影響Fig.4 Effect of time on the extraction rate of alkaloids

由圖4可知，諾麗果生物堿在30 min時達最高值，隨后開始下降。分析原因，可能是由于作用時間的延長，部分生物堿受熱分解或與提取物中其它成分發(fā)生了反應；另外，處理時間過久，由于超聲波長時間機械剪切作用，部分其它雜質的分解析出，也會對結果產生影響。

2.1.4 提取溫度對生物堿得率的影響

提取溫度對諾麗果生物堿得率的影響見圖5。

圖5 提取溫度對諾麗果生物堿得率的影響Fig.5 Effect of temperature on the extraction rate of alkaloids

由圖5可知，當?shù)陀?0℃時，隨著提取溫度的升高，諾麗果生物堿的得率也逐漸升高，當溫度超過70℃后，生物堿的得率有一定幅度的下降。分析原因，可能是因為高溫條件下，部分諾麗果生物堿結構不穩(wěn)定，發(fā)生了分解；另外，隨著溫度升高，乙醇的揮發(fā)速度加快，也會影響諾麗果生物堿的提取。因此選擇70℃作為諾麗果超聲輔助提取的溫度。

2.1.5 液料比對生物堿得率的影響

液料比對諾麗果生物堿得率的影響見圖6。

圖6 液料比對諾麗果生物堿得率的影響Fig.6 Effect of liquid-to-solid ratio on the extraction rate of alkaloids

由圖6可知，諾麗果生物堿得率先增大后減小，在液料比為30∶1（mL/g）時諾麗果生物堿的得率達到最大，超過30∶1（mL/g）時有下降的趨勢。這可能是隨著提取劑的量增大，諾麗果細胞內外的濃度差變大，導致細胞內擴散增強，傳質推動速度加快，諾麗生物堿大量溶出；而當提取劑的量過多時，超聲輻射大量分散于溶劑中，使物料可吸收的量變小，導致了諾麗生物堿得率降低。

2.1.6 超聲功率對生物堿得率的影響

超聲功率對諾麗果生物堿得率的影響見圖7。

由圖7可知，當功率達到400 W時，諾麗果生物堿得率達到最高值，隨后呈現(xiàn)下降的趨勢。主要原因可能是由于功率增大時，超聲波的機械剪切作用增強，破壞了諾麗的細胞壁，加快了有效生物堿成分的溶出；同時，超聲波處理強化溶劑的循環(huán)及傳質過程，也有利于諾麗生物堿的浸出；但超聲功率過高，部分諾麗生物堿的結構可能被破壞或發(fā)生分解。

圖7 超聲功率對諾麗生物堿得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of alkaloids

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 試驗結果與方差分析

響應面優(yōu)化試驗處理及結果見表2，響應面模型方差分析結果見表3。

表2 響應面優(yōu)化試驗結果Table 2 Response surface optimization test results

利用Design Expert 12.0軟件對表2試驗結果進行模型擬合分析，以諾麗果生物堿提取條件X1、X2、X3為自變量，其得率（Y）作為響應值得到回歸方程：Y=6.79+0.18X1+0.28X2+0.074X3+0.025X1X2+0.095 X1X3+0.077X2X3-0.14X12-0.36X22-0.25 X32。

通過表3方差分析對擬合模型進行評價可知，一次項和二次項均達到顯著水平以上，交互項X1X3，X2X3也達到了極顯著水平。失擬誤差（P=0.261 9>0.05），說明數(shù)據(jù)擬合效果較好，模型設計較為合理。決定系數(shù)R2=0.995 9，校正后系數(shù)值為R2Adj=0.990 6，說明響應面模型能準確地反映諾麗果生物堿得率與提取條件間的關系。試驗模型中變異系數(shù)（CV）為0.53%，處于較低范圍，模型具有較高的精確度。

表3 模型方差分析Table 3 Analysis of model variance

2.2.2 響應面圖形分析

根據(jù)試驗結果繪制諾麗生物堿得率的響應面與等高線見圖8～圖10。

通過圖形可評價各提取條件對諾麗生物堿得率的影響及因素間的交互作用，若等高線為圓形表示交互作用不顯著，若等高線為鞍形或橢圓形則表示交互作用顯著[18-20]；若響應面曲線走勢越陡，影響越顯著，曲線越平滑，影響越小[21-22]。從圖8～圖10的響應面和等高線的形狀可判斷，除提取時間與液料比外，其他因素之間均具有較顯著的交互作用；液料比的變化對諾麗果生物堿提取的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，超聲功率次之，提取時間曲線表現(xiàn)相對平滑。

圖8 提取時間和液料比響應面與等高線Fig.8 Response surface and contour of extraction time and liquid-material ratio

圖9 提取時間和超聲功率響應面與等高線Fig.9 Response surface and contour of extraction time and ultrasonic power

圖10 液料比和超聲功率響應面與等高線Fig.10 Response surface and contour of liquid-material ratio and ultrasonic power

2.2.3 最佳提取條件的確定

通過Design Expert 12.0軟件求解2.2.1所得回歸方程，得出最優(yōu)提取條件參數(shù)為：提取時間37.81 min，液料比 34.57∶1（mL/g），超聲功率 436.3 W，預測所得諾麗果生物堿得率為6.939 g/kg?？紤]到試驗過程的可操作性，將最優(yōu)諾麗生物堿提取試驗條件調整為提取時間 38 min、液料比為 35∶1（mL/g）、提取功率為 450 W。

按照最佳提取條件對諾麗果進行處理，驗證模型的準確度，共設置5次平行試驗，提取生物堿平均得率為6.932 g/kg，測定結果相對偏差為1.61%，提取測定結果準確度較高，與預測值基本相符，表明方法可行。

3 結論

通過本研究中單因素試驗及響應面優(yōu)化試驗結果，得出諾麗果生物堿的最佳提取條件為提取時間38 min、液料比 35∶1（mL/g）、超聲功率 450 W。 在此條件下對試驗結果進行驗證，諾麗果生物堿得率為6.932 g/kg，基本與響應面模型的理論預測值相符。本試驗提取條件和因素水平設置合理，試驗處理較少，模型預測結果準確，可用于諾麗果生物堿的提取及含量測定。