汪建紅

（內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川省高等學(xué)校果類(lèi)廢棄物資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川內(nèi)江641110）

色素是一類(lèi)重要的食品添加劑，在工業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)、日常生活等領(lǐng)域有較為廣泛的應(yīng)用。色素一般分為合成色素和天然色素兩類(lèi)[1]。合成色素由于存在較多的負(fù)面作用，比如致癌等，因此應(yīng)用受限[2-3]。天然色素主要源自動(dòng)植物，無(wú)毒或低毒，且存在一些特殊的功能性，因此應(yīng)用廣泛，尤其是在食品工業(yè)等領(lǐng)域[4-5]。荸薺皮作為荸薺副產(chǎn)物，含有較多的天然色素[6-8]。荸薺皮色素屬于黃酮類(lèi)色素，具有消炎、抗衰老、抗氧化等作用[9-10]。中國(guó)的荸薺年產(chǎn)量可達(dá)百萬(wàn)噸以上，而在加工和食用后被削下來(lái)的荸薺皮可占到荸薺鮮果總質(zhì)量的26%左右，因此開(kāi)發(fā)利用荸薺皮色素具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，可產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值，符合環(huán)保的社會(huì)理念，對(duì)于荸薺資源的綜合利用具有一定的意義[6]。

色素有諸多的提取方法，其中，有機(jī)溶劑直接浸提法[11-13]效率較低；酶法[14-15]后處理復(fù)雜，且酶易失活；超臨界二氧化碳法[16-17]所用設(shè)備較復(fù)雜，不適合于工業(yè)化生產(chǎn)。內(nèi)部沸騰法[18-19]、超聲波法[20-21]均具有操作簡(jiǎn)便、快速高效省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，且內(nèi)部沸騰法的機(jī)理和超聲波的空化效應(yīng)對(duì)色素提取的作用具有較好的一致性，均有利于色素從荸薺皮組織中解吸。超聲波輔助內(nèi)部沸騰法可使超聲波法的空化效應(yīng)和內(nèi)部沸騰達(dá)到很好的協(xié)同，加快植物組織內(nèi)外的對(duì)流速度，提高提取效率，因此本文采用超聲波輔助內(nèi)部沸騰法提取荸薺皮色素，以期獲得較好的提取效果。此外，考察荸薺皮色素的穩(wěn)定性、抗氧化性等性能，可為其開(kāi)發(fā)利用提供基本的參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 試劑及材料

荸薺：市售；95%乙醇、無(wú)水乙醇、冰乙酸、乙酸鈉晶體、氫氧化鈉、鄰二氮菲、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵晶體、30%雙氧水（均為分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DFT-100型手提式萬(wàn)能高速粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；BSA822型電子天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A型低速大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SHBB95型水循環(huán)多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；T-6型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PHS-3E型酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 荸薺皮色素的提取和測(cè)定

參考文獻(xiàn)方法[22-23]，稱(chēng)取1.00g荸薺皮粉末于100mL三頸瓶中，加入5 mL 95%乙醇，并在25℃左右溫度下浸泡30 min，然后加入不同溫度的50%乙醇溶液，迅速安裝好裝置，在約38 kPa壓力下和不同功率下進(jìn)行超聲波處理，并在不同溫度下回流一定時(shí)間。冷卻后，離心獲取上清液，并過(guò)濾上清液。將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用30%乙醇溶液定容。

用移液管從容量瓶中移取2.00 mL液體到比色管中，并用蒸餾水稀釋至10 mL。根據(jù)參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[23]，在430 nm下測(cè)定稀釋后液體吸光度。根據(jù)朗伯-比爾定律，濃度和吸光度之間存在正相關(guān)的關(guān)系，因此本試驗(yàn)利用測(cè)得的吸光度值大小來(lái)衡量提取的荸薺皮色素濃度大小。

2.2 單因素試驗(yàn)

為了初步優(yōu)化荸薺皮色素的提取工藝條件，采用每一組固定液料比、功率、溫度和時(shí)間4個(gè)因素中3個(gè)因素，只改變其中1個(gè)因素的方法，先后研究液料比[15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1（mL/g）]、功率（160、200、240、280、320、360、400 W）、溫度（40、50、60、70、80 ℃）和時(shí)間（10、20、30、40、50 min）對(duì)色素提取效果的影響，重復(fù)2.1的操作步驟。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇4個(gè)因素中影響相對(duì)顯著的3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，以吸光度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面模型，并按照此模型安排試驗(yàn)。

2.4 色素穩(wěn)定性測(cè)定

在響應(yīng)面試驗(yàn)得出的最佳條件下，按照2.1的方法獲得50 mL提取液，分別從提取液中移取2.00 mL溶液到 8 支比色管中，然后分別用 pH 值為 3、4、5、6、7、8、9、10的磷酸緩沖溶液稀釋到10 mL，25℃左右溫度下放置3 h，在430 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。

2.5 羥基自由基清除率的測(cè)定

在優(yōu)化后的最佳條件下，按照2.1的方法獲得50mL提取液， 分別從此提取液中移取 0、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL溶液到6支比色管中，分別用蒸餾水稀釋至10 mL，然后按照文獻(xiàn)方法[8，24]測(cè)定其對(duì)羥基自由基的清除率。

2.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)的每組試驗(yàn)條件均作了3次平行試驗(yàn)，然后取其平均值。單因素試驗(yàn)的結(jié)果采用origin 75軟件繪圖。響應(yīng)面試驗(yàn)采用Box-Behnken軟件設(shè)計(jì)模型，試驗(yàn)結(jié)果采用Design Expert 8.0軟件分析處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 液料比的影響

液料比對(duì)荸薺皮色素吸光度的影響見(jiàn)圖1。

從圖 1 可看到，當(dāng)液料比小于 45∶1（mL/g）時(shí)，荸薺皮色素吸光度隨液料比的增加而增加，在液料比45∶1（mL/g）時(shí)達(dá)到最大值；液料比超過(guò) 45∶1（mL/g）后，隨溶劑增多，吸光度逐漸減小。出現(xiàn)該變化的原因是：溶劑用量的增加會(huì)使能溶解的色素的量增加，但也會(huì)增加溶解浸出的脂溶性雜質(zhì)的量，脂溶性雜質(zhì)過(guò)多時(shí)會(huì)造成荸薺皮組織內(nèi)外對(duì)流通道的堵塞，進(jìn)而影響色素的浸出[23]。 因此，選擇最佳液料比為45∶1（mL/g）。

圖1 液料比的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio

3.1.2 功率的影響

功率對(duì)荸薺皮色素吸光度的影響見(jiàn)圖2。

圖2 功率的影響Fig.2 Effect of power

從圖2可看到，當(dāng)功率小于280 W時(shí)，色素吸光度隨功率增加而增大，最大值出現(xiàn)在280 W處；功率超過(guò)280 W后，隨功率增大，吸光度逐漸降低。出現(xiàn)該變化趨勢(shì)的原因是：功率的增大會(huì)使超聲波的空化效應(yīng)等作用增強(qiáng)，這對(duì)色素提取來(lái)說(shuō)是有利的；但功率過(guò)高時(shí)會(huì)使色素穩(wěn)定性下降，進(jìn)而變質(zhì)，不利于色素提取[25]。因此，選擇最佳功率為280 W。

3.1.3 溫度的影響

溫度對(duì)荸薺皮色素吸光度的影響見(jiàn)圖3。

從圖3可看到，當(dāng)溫度低于60℃時(shí)，隨溫度升高色素吸光度逐漸增大；當(dāng)溫度高于60℃時(shí)，隨溫度升高色素吸光度逐漸減小。出現(xiàn)該變化趨勢(shì)的原因是：溫度的升高會(huì)使分子運(yùn)動(dòng)更活躍，內(nèi)部沸騰更劇烈，和超聲波空化效應(yīng)協(xié)同起來(lái)對(duì)荸薺皮中未解吸的色素的沖擊作用更強(qiáng)，促進(jìn)色素解吸進(jìn)入溶液中，這對(duì)色素提取來(lái)說(shuō)是有利的；但溫度過(guò)高時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)的過(guò)分活躍會(huì)造成荸薺皮組織內(nèi)外對(duì)流通道的堵塞，過(guò)高的溫度還會(huì)使超聲波空化效應(yīng)被一定程度削弱，影響色素浸出，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致溶劑的揮發(fā)量增加[25-28]。因此，選擇提取的最佳溫度為60℃。

圖3 溫度的影響Fig.3 Effect of temperature

3.1.4 時(shí)間的影響

時(shí)間對(duì)荸薺皮色素吸光度的影響見(jiàn)圖4。

圖4 時(shí)間的影響Fig.4 Effect of time

從圖4可看到，當(dāng)時(shí)間小于20 min時(shí)，色素吸光度隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增大，吸光度最大值出現(xiàn)在20 min處；超過(guò)20 min后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，吸光度逐漸降低。出現(xiàn)該變化趨勢(shì)的原因是：時(shí)間的延長(zhǎng)能使荸薺皮中的色素更充分解吸并浸入溶液中，使組織內(nèi)外色素的濃度更趨于平衡；但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，在超聲波作用下已經(jīng)浸出的部分色素會(huì)發(fā)生分解變質(zhì)，也會(huì)導(dǎo)致更多的溶劑揮發(fā)，使已溶解的色素以固體形式重新析出。因此，選擇提取的最佳時(shí)間為20 min。

3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，功率對(duì)色素提取的直接影響相對(duì)較小，因此選擇固定功率為280 W，以液料比（A）、溫度（B）、時(shí)間（C）為因素，以色素吸光度（R）為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，因素水平如表1所示，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels in response surface experiments

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design arrangement and results

利用Design Expert 8.0軟件分析試驗(yàn)結(jié)果得出模型的二次回歸方程為：R=0.91+0.032A-0.13B-0.087C-0.0055AB+0.032AC-0.12BC-0.021A2-0.14B2-0.068C2。

該擬合的二次模型的方差分析如表3所示，各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線如圖5～圖7所示。

圖5 液料比和溫度的等高線和響應(yīng)面圖Fig.5 Contour plot and response surface diagram of liquid-solid ratio and temperature

表3 擬合模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the fitted model

從表3的方差分析可知，模型P＜0.000 1，影響高度顯著，失擬項(xiàng)P=0.467 9＞0.05，影響不顯著，說(shuō)明使用該模型來(lái)優(yōu)化荸薺皮色素的提取工藝條件是合適的。該模型的R2=0.995 4，且變異系數(shù)C.V.%較低，為1.92%，說(shuō)明該模型可靠性和精度較高。

一次項(xiàng)中A（液料比）、B（溫度）、C（時(shí)間）影響均高度顯著，交互項(xiàng)和二次項(xiàng)中，BC、B2、C2影響高度顯著，AC影響極顯著，A2影響顯著，AB影響不顯著，表明各影響因素和響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。從F值還可看到各因素影響的主次順序?yàn)椋築>C>A。

從圖5～圖7可看到3個(gè)因素彼此之間存在交互作用，對(duì)色素提取液吸光度的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，從響應(yīng)面圖的曲線可看到：溫度影響使曲線更陡峭，時(shí)間次之，液料比最為平緩，與方差分析的結(jié)果一致。

圖6 液料比和時(shí)間的等高線和響應(yīng)面圖Fig.6 Contour plot and response surface diagram of liquid-solid ratio and time

圖7 溫度和時(shí)間的等高線和響應(yīng)面圖Fig.7 Contour plot and response surface diagram of temperature and time

另外，利用Design Expert 8.0軟件還得出超聲波輔助內(nèi)部沸騰法提取荸薺皮色素的最佳工藝條件為：液料比 48.8∶1（mL/g），溫度 55.64 ℃和時(shí)間 19.09 min?？紤]到試驗(yàn)操作的實(shí)際情況，將該條件修正為：液料比 50∶1（mL/g），溫度 60 ℃，時(shí)間 20 min，該條件下的理論預(yù)測(cè)值為0.921。此條件下5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)的平均值為0.911，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.59%，與理論值0.921的相對(duì)偏差為-1.09%。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

pH值對(duì)荸薺皮色素吸光度的影響如表4所示。

表4 pH值對(duì)色素穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of pH on stability of pigment

從表4可看到，相對(duì)于中性而言，酸性條件下色素提取液吸光度有一定程度的下降，堿性條件下提取液吸光度卻明顯增加。荸薺皮色素主要為黃酮類(lèi)色素，黃酮的結(jié)構(gòu)中存在大量的內(nèi)醚鍵和酚羥基，酸性條件下荸薺皮色素黃酮結(jié)構(gòu)中的部分內(nèi)醚鍵發(fā)生了斷裂，使其顏色變?nèi)酰欢鴫A性條件下，黃酮結(jié)構(gòu)中的酚羥基會(huì)轉(zhuǎn)化為氧負(fù)離子，使其供電子能力增強(qiáng)，從而產(chǎn)生增色效果。

3.4 羥基自由基清除率

對(duì)色素提取液進(jìn)行不同程度稀釋后，所得溶液對(duì)羥基自由基清除率的測(cè)定結(jié)果如表5所示。

表5 色素對(duì)羥基自由基的清除率Table 5 Clearing rate of pigment for hydroxyl radical

從表5中可看到隨著溶液濃度增大，其對(duì)羥基自由基的清除率逐漸增大；當(dāng)稀釋液濃度達(dá)到原提取液0.6倍時(shí)，清除率就已大于50%，未經(jīng)稀釋的原液的羥基自由基清除率甚至可達(dá)97.38%，說(shuō)明荸薺皮色素的黃酮結(jié)構(gòu)賦予了其較強(qiáng)的抗氧化活性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)利用超聲波輔助內(nèi)部沸騰法提取荸薺皮色素，根據(jù)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得出最佳提取工藝條件為：超聲波功率280 W，液料比 50∶1（mL/g），溫度60℃，時(shí)間20 min，該條件下的理論預(yù)測(cè)值為0.921。此條件下5次平行試驗(yàn)的平均吸光度值為0.911（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.59%），與理論值0.921的相對(duì)偏差為-1.09%。

穩(wěn)定性試驗(yàn)表明酸性條件下，色素吸光度有一定的下降；堿性條件下，色素吸光度有一定程度的增大?？寡趸钚匝芯勘砻?，色素濃度越高對(duì)羥基自由基的清除率越大，本試驗(yàn)色素提取液對(duì)羥基自由基的清除率甚至可達(dá)97.38%，說(shuō)明荸薺皮色素具有較強(qiáng)的抗氧化活性。這些結(jié)論為荸薺皮色素開(kāi)發(fā)利用提供了一定的基本參考依據(jù)。