張 翀，雷艷平，王丹妮，胡宗忠，田玉庭,

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350001；2.福建省潘氏食品有限公司，福建三明 365050）

醬油是一種歷史悠久的發(fā)酵調(diào)味品，迄今已有兩千多年歷史[1]，其釀造工藝為使用大豆或豆粕為蛋白質(zhì)原料，面粉或小麥麩皮為淀粉原料，熟化后加入曲霉等微生物培養(yǎng)曲料，通過微生物產(chǎn)生的蛋白酶、淀粉酶等豐富酶系的降解作用和后期其他微生物的協(xié)同發(fā)酵下，獲得色香味俱全的優(yōu)質(zhì)調(diào)味品[2]。隨著中國經(jīng)濟(jì)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，人們生活水平顯著提高，對醬油的品質(zhì)有了更高要求，醬油工業(yè)的發(fā)酵方法經(jīng)歷了從以追求生產(chǎn)效率高的低鹽固態(tài)發(fā)酵法為主，到以逐漸注重醬油風(fēng)味品質(zhì)的現(xiàn)代高鹽稀態(tài)發(fā)酵法為主。醬油風(fēng)味品質(zhì)的追求，其本質(zhì)是對于醬油產(chǎn)品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和總量的追求。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)作為醬油風(fēng)味品質(zhì)的重要組成部分，對醬油的香氣和口感都有重要影響[3]。目前，國內(nèi)外對醬油香氣已進(jìn)行了大量研究，Steinhaus等[4]使用芳香提取物稀釋分析技術(shù)（Aroma extract dilution analysis，AEDA）研究日本醬油，認(rèn)為3-甲基丁醛等13 種揮發(fā)性物質(zhì)是醬油中的主要香氣物質(zhì)；趙佳豪等[5]利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）對比了中日醬油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯、2-苯乙醇等共17 種差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，造成了中日醬油香氣上的差異；張艷芳等[6]從低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油和高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中分析鑒定出52 種揮發(fā)性物質(zhì)，并對比出1-辛烯-3-醇為低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油主要成分，4-乙基愈創(chuàng)木酚為高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油主要成分。無論是低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油、高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油，還是國內(nèi)外不同的醬油，均有研究者進(jìn)行了大量的研究，而對醬油發(fā)酵過程中稀醪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究卻鮮見報道。

紅曲為曲霉科真菌紅曲霉（Monascus purpureusWent.）附著在粳米上的俗稱，一般常用于黃酒[7]、醋[8]等調(diào)味品的發(fā)酵，其發(fā)酵過程中能夠分泌輔酶Q10和洛伐他汀等抗氧化物質(zhì)，具有降低血脂和預(yù)防癌癥等作用[9]。趙吉興[10]研究證明醬油中添加紅曲后紅色指數(shù)和色澤有明顯增強(qiáng)，陳之瑤等[11]研究認(rèn)為使用紅曲制作的糖化增香曲進(jìn)行醬油混合制曲能夠增加氨基態(tài)氮等理化性質(zhì)，Hsiao等[12]在醬油發(fā)酵中添加紅曲霉，發(fā)現(xiàn)醬油的氨態(tài)氮和谷氨酸含量均有所提高。Lim等[13]利用紅曲霉固態(tài)發(fā)酵大豆，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液酚含量和清除自由基能力有明顯提高。目前對于添加紅曲后釀造風(fēng)味的變化并未見有詳細(xì)研究。

本研究通過優(yōu)化頂空固相微萃取的萃取參數(shù)選擇一種適用于提取和分析醬油稀醪中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的萃取方法，并對添加紅曲霉菌混合制曲后的不同發(fā)酵時間段的稀醪樣品香氣成分進(jìn)行分析，進(jìn)一步研究紅曲釀造醬油風(fēng)味物質(zhì)的發(fā)酵變化，為更有效利用紅曲和提升醬油的品質(zhì)提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高鹽稀態(tài)醬油稀醪（主要原料為脫脂豆粕、麩皮、水、氯化鈉等，鹽度為17%，稀醪發(fā)酵10、30、50、70、80、120、160 d；編號分別為a、b、c、d、e、f、g）由福建省潘氏食品有限公司提供，采用混菌制曲發(fā)酵（含紅曲霉菌、米曲霉）；WSD生抽醬油、MT生抽醬油 購自當(dāng)?shù)爻校?-辛醇（色譜純）購自美國Sigma公司；其他試劑 均為色譜純或分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

GC-2010-DSQ II氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HPINNOWAX氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）

美國Agilent公司；固相微萃取（SPME）裝置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（DCP）、75 μm CAR/PDMS萃取頭（CP）、65 μmDVB/PDMS萃取頭（DP）美國Supelco公司；15 mL頂空鉗口樣品瓶 上海安譜公司；DF-1 型號集熱式磁力攪拌器金壇市鑫渃實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 萃取頭篩選試驗(yàn) 將醬醪取1850 mg（約1.6 mL）移入頂空萃取瓶中，添加2.0 g氯化鈉、2 μL的內(nèi)標(biāo)2-辛醇（10 mg/L），放入磁力攪拌轉(zhuǎn)子，置于恒溫加熱磁力攪拌器中，50 ℃水浴10 min預(yù)熱，隨后將老化后的萃取頭插入頂空瓶中，推出纖維頭進(jìn)行萃取，保持50 ℃恒溫水浴萃取30 min，重復(fù)3 次。篩選相似度>80%的有效揮發(fā)性物質(zhì)，對50/30 μm DVB/CAR/PDMS、75 μm CAR/PDMS、65 μm DVB/PDMS三種萃取頭萃取醬油稀醪30 d的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析比較。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 以總峰面積和主要揮發(fā)性物質(zhì)（A：乙酸；B：正己醇；C：2-壬基酮；D：3-呋喃甲醇；E：苯乙醇；F：2-甲氧基苯酚；G：3-甲基丁酸；H：2-甲基丙酸；I：2-甲氧基-4-乙烯基苯酚；J：2/3-甲基丁醇乙酸酯）的相對峰面積（即每個考察點(diǎn)相對于第一個考察點(diǎn)峰面積的相對百分?jǐn)?shù)，如氯化鈉添加量1.0 g的相對峰面積為100%）確定該萃取頭頂空固相微萃取的條件。考察氯化鈉添加量（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g），萃取溫度50 ℃，萃取時間30 min；考察萃取溫度（40、45、50、55、60 ℃），氯化鈉添加量1.5 g，萃取時間30 min；考察萃取時間（10、20、30、40、50 min），氯化鈉添加量1.5 g，萃取溫度50 ℃；最后在最佳萃取條件下對醬油稀醪不同時期中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析。

1.2.3 GC-MS分析 毛細(xì)管色譜柱：HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：高純度氦氣，柱流量：1 mL/min，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；離子源：EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 33～500；ACQ方式 Scan MS，接口溫度250 ℃，連接桿溫度150 ℃。

程序升溫：起始溫度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至120 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升至 220 ℃，保留8 min；后運(yùn)行溫度240 ℃，后運(yùn)行時間5 min。

1.3 數(shù)據(jù)分析

定性方法：將測得物質(zhì)譜圖與 NIST11 和Wiley中標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行檢索對比，并與相關(guān)文獻(xiàn)報道的揮發(fā)性物質(zhì)描述和保留指數(shù)相比較，確證所檢出紅曲醬油中香氣物質(zhì)的各種化學(xué)成分。

定量方法：采用半定量方法，添加 2 μL 2-辛醇（10 mg/L）作為內(nèi)標(biāo)，再利用被測物與內(nèi)標(biāo)物面積的比值來計(jì)算各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的質(zhì)量濃度。

采用Excel 2016 對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步的分析整理，使用Origin 2017 軟件和R軟件繪制熱圖（Heatmap）進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳萃取頭選擇

本實(shí)驗(yàn)比較了50/30 μm CAR/ DVB/PDMS萃取頭（CDP）、75 μm CAR/PDMS萃取頭（CP）、65 μm DVB/PDMS萃取頭（DP）在頂空固相微萃?。℉SME）中對萃取揮發(fā)性成分的影響。由圖1 萃取頭的質(zhì)譜圖可知，三種萃取頭之間萃取效果具有顯著差異，萃取頭DP萃取物質(zhì)相較于萃取頭CP和萃取頭CDP，物質(zhì)種類和總量皆明顯少于后兩種萃取頭，萃取頭CP與CDP相比出峰數(shù)量較為接近。

圖1 不同萃取頭質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of different extraction heads

由圖1 可知萃取頭CP萃取得到54 種揮發(fā)性化合物，萃取頭CDP萃取得到56 種揮發(fā)性化合物，萃取頭DP萃取得到48 種揮發(fā)性化合物，說明萃取頭CP和CDP在萃取效果具有相似水平，且優(yōu)于萃取頭DP。從不同萃取頭萃取物質(zhì)的總質(zhì)量來看，可初步看出萃取頭CP的萃取效果則明顯優(yōu)于其他兩種萃取頭。進(jìn)一步通過主成分分析法（PCA）對萃取頭萃取數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2 所示。第一主成分（PC1）貢獻(xiàn)率占52.5%，第二主成分（PC2）貢獻(xiàn)率占37.1%，累計(jì)達(dá)89.6%，符合主成分分析的要求，能夠包含大部分原始變量信息[14]。

圖2 不同萃取頭主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis of different extraction heads

由圖2（主成分分析圖）可知，含有DVB涂層的萃取頭DP和CDP落在PC1 的負(fù)半軸部分，而萃取頭CP落在PC1 軸的正半軸。從PC2 軸上看，萃取頭CDP在正半軸，萃取頭CP和DP在負(fù)半軸上。說明三種萃取頭萃取的揮發(fā)性化合物種類和濃度具有顯著差異。

由圖3（載荷圖）可知，分子量較大的大多處于PC1 的負(fù)半軸，如2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、苯乙酸甲酯、2,6-二甲氧基苯酚、2-苯乙酯乙酸、苯乙酸乙酯、2-甲氧基-3-（2-丙烯基）苯酚、2,4-雙（1,1-二甲基乙基）苯酚等芳香族和雜環(huán)類大分子物質(zhì)，說明萃取頭DP和CDP對此類物質(zhì)具有較強(qiáng)的吸附能力。這是因?yàn)檩腿☆^中的DVB涂料中的苯環(huán)由于相似相溶原理，對芳香族和雜環(huán)類物質(zhì)具有更強(qiáng)的萃取能力。同時由載荷圖可知，小分子化合物（No.1～23）除乙酰胺（No.2）和吡啶（No.5）位于PC1 負(fù)半軸外，其他都在正半軸，且大部分位于第四象限。說明萃取頭CP對于低分子量、低沸點(diǎn)的化合物具有最佳的萃取效果，這與顧苑婷等[15]的研究報道相一致?？梢缘贸霾挥幂腿∮芯邆洳煌妮腿?yōu)點(diǎn)，萃取頭DP和CDP對大分子、高沸點(diǎn)物質(zhì)萃取效果較佳，CP對于低沸點(diǎn)的香氣物質(zhì)萃取效果較佳。

圖3 不同萃取頭主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis of different extraction heads

綜合以上分析，選取萃取頭CP作為醬醪頂空固相微萃取的最佳萃取頭進(jìn)行下一步研究。

2.2 頂空固相微萃取條件優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 氯化鈉添加量對頂空固相微萃取的影響 醬油稀醪在頂空固相微萃取過程中需要加入蒸餾水對其進(jìn)行稀釋，其溶液中的離子強(qiáng)度將會降低。頂空固相微萃取SPME萃取體系中加入氯化鈉，能夠利用溶液中鹽離子的“鹽析”作用進(jìn)行增強(qiáng)分析靈敏度和提高萃取效率[16]。研究氯化鈉添加量對SPME萃取醬醪中揮發(fā)性物質(zhì)的影響，結(jié)果如圖4 所示（以氯化鈉添加1.0 g為100%）。隨著氯化鈉添加量的增加，相對總峰面積逐漸增加，氯化鈉添加2.5 g時達(dá)到峰值，隨后相對總峰面積下降。10 種主要物質(zhì)中，除物質(zhì)H（2-甲基丙酸）外，其他物質(zhì)的相對峰面積皆在2.5 g處達(dá)到峰面積，其中3-呋喃甲醇、苯乙醇、2-甲氧基苯酚在2.5 g處具有顯著差異（P<0.05）。說明氯化鈉的添加對SPME具有較大的促進(jìn)作用，當(dāng)添加量大于2.5 g時具有反作用。因此，選擇氯化鈉添加量2.5g為SPME的最適添加量。

圖4 不同氯化鈉添加量萃取物質(zhì)相對峰面積對比Fig.4 Comparison of relative peak areas of extracted substances with different sodium chloride additions

2.2.2 萃取溫度對頂空固相微萃取的影響 SPME的萃取溫度對萃取體系分析物的擴(kuò)散速度具有重要影響，王志娟等[17]發(fā)現(xiàn)在一定溫度范圍內(nèi),溫度升高促進(jìn)易揮發(fā)成分到達(dá)頂空及萃取纖維層表面。因此，選擇合適的溫度在研究高鹽稀態(tài)醬油醬醅的揮發(fā)性成分具有重要意義。經(jīng)研究分析，結(jié)果如圖5 所示，總峰面積的相對峰面積隨著溫度的升高而提高，40 ℃（相對40 ℃時的總峰面積為100%，下同）和45 ℃（相對于40 ℃時總峰面積的百分比102.53%）較為接近，50 ℃（120.94%）和55 ℃（123.80%）較為接近，60 ℃（133.66%）最高，說明溫度的升高能夠提高分析物的擴(kuò)散速度和萃取效率。10 種揮發(fā)性化合物的相對峰面積中，物質(zhì)BCDEFI遵循相對總峰面積的增長趨勢，但是物質(zhì)BCDF在溫度60 ℃處出現(xiàn)了不正常的增長，除物質(zhì)B在55 ℃處有略微下降外，BCDF均在60 ℃處突然上升；相反的，物質(zhì)AHJ的相對峰面積呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，均在50 ℃出現(xiàn)峰值，尤其是物質(zhì)HJ在溫度60 ℃處出現(xiàn)相對峰面積低于100%（分別為73.33%和43.65%）的情況；物質(zhì)G的趨勢則是在波動，且在50 ℃（125.10%）和60 ℃（128.41%）出現(xiàn)較高且相接近的相對峰面積。綜合以上情況說明，溫度對不同化合物的影響程度不同，以物質(zhì)C（相對分子質(zhì)量142）為代表的大分子化合物在溫度較高時的釋放度增加，更快的吸附至萃取頭中，由于吸附面積的一定，產(chǎn)生了競爭性吸附，從而降低其他物質(zhì)的待分配系數(shù)，出現(xiàn)相對峰面積低于100%的情況，此情況與尹建邦的研究[18]相一致。因此，從萃取揮發(fā)性物質(zhì)的豐度和相對濃度的角度來選擇，把50 ℃作為最適的溫度，作為后續(xù)研究的萃取溫度。

圖5 不同萃取溫度萃取物質(zhì)相對峰面積對比Fig.5 Comparison of relative peak areas of extracted substances at different extraction temperatures

2.2.3 萃取時間對頂空固相微萃取的影響 萃取時間指的是SPME時達(dá)到平衡所需要的時間，此時固相萃取頭的吸附物質(zhì)相對飽和，且萃取物質(zhì)的組成較為合理，過長的萃取時間會改變原本萃取物質(zhì)的組成成分，并有可能吸附水蒸氣，降低萃取頭使用壽命和增加柱流失。因此，本文研究了不同萃取時間對SPME萃取高鹽稀態(tài)醬油醬醅中的揮發(fā)性成分的影響，結(jié)果見圖6（以萃取時間10 min為100%）。相對總峰面積隨著時間的增加而不斷增長，揮發(fā)性物質(zhì)DEGHJ均在30 min時有最大的相對峰面積，說明此類物質(zhì)達(dá)到平衡的時間為30 min較為合適。具有高沸點(diǎn)、低分配系數(shù)的物質(zhì)I（即2-甲氧基-4-乙烯基苯酚）的峰面積在40 min之后峰面積快速增長，說明此類物質(zhì)需要較長時間的萃取?？軙粤盏萚19]進(jìn)行的研究同樣說明，過長時間的萃取會導(dǎo)致高沸點(diǎn)物質(zhì)的占比顯著增加。因而可能導(dǎo)致對醬醅中揮發(fā)性成分構(gòu)成研究的失真。因此，本研究認(rèn)為選擇萃取時間30 min較為合適，并以此作為后續(xù)研究的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。

圖6 不同萃取時間萃取物質(zhì)相對峰面積對比Fig.6 Comparison of relative peak areas of extracted substances at different extraction times

綜上所述，篩選出使用75 μm CAR/PDMS萃取頭的最佳頂空微萃取條件為將醬醪取1850 mg（約1.6 mL）移入頂空萃取瓶中，添加2.5 g氯化鈉，2 μL的內(nèi)標(biāo)2-辛醇（10 mg/L），放入磁力攪拌轉(zhuǎn)子，置于恒溫加熱磁力攪拌器中，50 ℃水浴10 min預(yù)熱，隨后將老化后的萃取頭插入頂空瓶中，推出纖維頭進(jìn)行萃取，保持50 ℃恒溫水浴萃取30 min。

2.3 最佳萃取條件下紅曲醬油稀醪揮發(fā)性物質(zhì)變化分析

2.3.1 紅曲醬油與其他醬油揮發(fā)性物質(zhì)對比 使用上述最佳萃取條件對紅曲高鹽稀態(tài)醬油稀醪發(fā)酵160 d（HQ）、WSD生抽醬油（WSD）和MT生抽醬油（MT）進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)分析，由表1可知，HQ種類數(shù)最多，共計(jì)58 種，其中酯類物質(zhì)有15 種，酯類占比最高，為50.94%±6.67%；WSD有48 種揮發(fā)類物質(zhì)，吡嗪類數(shù)量最多，為13 種，但揮發(fā)類物質(zhì)中占比最高的為酚類物質(zhì)；MT的數(shù)量最少，為46 種，但其種類物質(zhì)較為均勻，酮類物質(zhì)數(shù)量最多，為8 種，而占比最高的物質(zhì)類別為醇類。已有研究證明[20]，酯類物質(zhì)自身具有果香、花香、蜂蜜香等芳香氣味外，還能夠調(diào)和其他物質(zhì)的刺激感和苦味，緩沖鹽的咸味，促進(jìn)苯乙醇等風(fēng)味物質(zhì)的香氣，賦予醬油更多的風(fēng)味，是醬油中的重要風(fēng)味物質(zhì)[21]。因此能夠認(rèn)為紅曲醬油的主要揮發(fā)性物質(zhì)為酯、醇、酸、酮，與市場上現(xiàn)有的以醇、酚為主要揮發(fā)類物質(zhì)的醬油產(chǎn)品具有明顯差異。

表1 不同醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)類別對比Table 1 Comparison of volatile flavor compounds in different soy sauces

2.3.2 紅曲醬油發(fā)酵期物質(zhì)種類含量變化 根據(jù)上述SPME最優(yōu)條件實(shí)驗(yàn)，對紅曲高鹽稀態(tài)醬油稀醪不同發(fā)酵時期（發(fā)酵10、30、50、70、80、120、160 d；編號分別為a、b、c、d、e、f、g）的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析研究，結(jié)合NIST11.0 數(shù)據(jù)庫比對和內(nèi)標(biāo)法計(jì)算。所有紅曲醬油稀醪中檢測分類出醇類（14 種）、酸類（7 種）、酮類（9 種）、酯類（15 種）、酚類（6 種）、醛類（3 種）、吡嗪類（3 種）、吡咯類（1 種）、烯類（1 種）、呋喃類（2 種）和其他（4 種），共11 大類，65 種揮發(fā)性物質(zhì)。由圖7 可知，揮發(fā)性物質(zhì)總量變化趨勢呈現(xiàn)波動上升，在發(fā)酵30 d和80 d出現(xiàn)兩個波峰，其中80 d為最高峰（312.19±39.62）μg/kg。

圖7 不同時期醬醪不同種類物質(zhì)對比Fig.7 Comparison of different substances in sauce mash in different periods

對比稀醪發(fā)酵前后（a與g處）可以發(fā)現(xiàn)，醇類、酮類、醛類、吡嗪類、烯類和其他類的物質(zhì)含量是下降的，其中，醇類的下降尤為明顯，接近50%；酸類、酯類、酚類、吡咯類和呋喃類的物質(zhì)含量是增加的，其中，酯類和呋喃類物質(zhì)的增加倍數(shù)接近或超過兩倍。說明在高鹽稀態(tài)醬油稀醪發(fā)酵時，揮發(fā)性物質(zhì)變化主要是醇類物質(zhì)的下降和酯類、呋喃類物質(zhì)的生成。綜上說明加入紅曲霉對釀造醬油的揮發(fā)性風(fēng)味，具有顯著作用，對改善高鹽稀態(tài)醬油的發(fā)酵工藝具有重要參考價值。

2.3.3 揮發(fā)性物質(zhì)變化分析 本研究在對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類熱圖分析，使用HemI軟件繪制圖表，結(jié)果如圖8 所示。由圖8 可知，紅曲醬油高鹽稀態(tài)發(fā)酵50 d和80 d是揮發(fā)性香氣物質(zhì)生成的關(guān)鍵時期，在此時期大量的揮發(fā)性物質(zhì)具有顯著變化，且在發(fā)酵后期（80～160 d）大部分物質(zhì)含量出現(xiàn)了增加。

圖8 不同發(fā)酵時期醬醅主要揮發(fā)性物質(zhì)熱圖Fig.8 Heat map of main volatile substances in soy sauce mash at different fermentation periods

14 種醇類揮發(fā)性物質(zhì)有9 種物質(zhì)在不同的發(fā)酵過程中具有顯著變化，正己醇C8、2-甲基丙醇C2；苯乙醇C11、2-戊醇C5；1-辛烯-3-醇C12、苯甲醇C10、3-（甲硫基）丙醇C9、3-甲基2-丁烯-1 醇C3、正丁醇C1。醬油中的揮發(fā)性醇類物質(zhì)主要兩個來源：一是原料成分；二是發(fā)酵過程中的微生物代謝，主要是人為添加酵母的發(fā)酵，包括酒精發(fā)酵、氨基酸的還原反應(yīng)和生物合成，以及碳水化合物的代謝途徑[22]?？梢园l(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前中期醇類物質(zhì)形成的物質(zhì)種類較少，正己醇和2-甲基丙醇含量減少，但醇類物質(zhì)含量基本保持不變，說明醇類物質(zhì)在稀醪發(fā)酵的前期主要為微生物的代謝，且保持相對平衡。被認(rèn)為有玫瑰香氣的苯乙醇主要的增長期為發(fā)酵中期，說明該時期是酵母菌發(fā)酵降解苯丙氨酸的高活性階段[23]。正己醇一般認(rèn)為來自于制曲原料中，具有一定的青草味[24]，隨著發(fā)酵時間增加，正己醇的含量逐漸減少，說明其被微生物代謝利用或參與酯化反應(yīng)。在發(fā)酵后期的80 d，醇類物質(zhì)含量顯著增長，主要為1-辛烯-3-醇C12、苯甲醇C10、3-（甲硫基）丙醇C9、3-甲基2-丁烯-1 醇C3、正丁醇C1 等5 種醇類物質(zhì)含量的增長。李楊等[25]研究認(rèn)為1-辛烯-3-醇是米曲霉孢子的特征性揮發(fā)性成分，帶有一種蘑菇的香氣，可能主要來源于大曲發(fā)酵階段。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵后期該物質(zhì)具有顯著變化，說明在發(fā)酵后期同樣能夠生成，或者說1-辛烯-3-醇的來源并非只有大曲培養(yǎng)階段。

醛酮類物質(zhì)一般是具有令人愉悅的揮發(fā)性物質(zhì)，如甜香、草香、焦香等[25]，能夠增強(qiáng)醬油的風(fēng)味。本實(shí)驗(yàn)發(fā)酵樣品中的酮類變化較顯著的分別為前期的乙偶姻T1、4-羥基-2-甲基苯乙酮T8 和中期的苯乙酮T4、異佛爾酮T2；醛類變化顯著的有前期的3-甲基2-丁烯醛Q1 和中期的苯甲醛Q3。可以發(fā)現(xiàn)酮類物質(zhì)和醛類物質(zhì)含量的主要變化集中在發(fā)酵的前中期，說明醬油稀醪發(fā)酵前中期是醛酮類生成的關(guān)鍵時期。醬油中的醛酮類主要來自氨基酸的降解、微生物發(fā)酵代謝和脂類的氧化[26]，如苯甲醛可由乳酸菌通過代謝產(chǎn)生，其前體物是苯丙氨酸[27]。

醬油中的雜環(huán)類物質(zhì)有吡嗪、呋喃、吡咯、酚類化合物等，這些物質(zhì)能夠賦予醬油特殊風(fēng)味，如具有堅(jiān)果香的2,5-二甲基吡嗪、煙熏味的愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚等[28]。在稀醪發(fā)酵樣品中發(fā)現(xiàn)2,5-二甲基吡嗪B2、甲基吡嗪B1、2-甲基-3-異丙基吡嗪B3 三種吡嗪類物質(zhì)的顯著變化均在稀醪發(fā)酵的前期，說明吡嗪類物質(zhì)的生成主要在稀醪發(fā)酵前期，吡嗪類物質(zhì)的生成是由L-抗壞血酸（ASA）與L-谷氨酸（Glu）/L-天冬氨酸（Asp）進(jìn)行的美拉德反應(yīng)[29]。2,3-二氫苯并呋喃N2 同樣在稀醪發(fā)酵的前期具有顯著性增長，與后期含量逐漸增多的3-呋喃甲醇N1 不同。吡咯類中2-乙酰吡咯L1 和部分酚類物質(zhì)2-甲氧基苯酚（愈創(chuàng)木酚）F3、苯酚F1 則主要在稀醪發(fā)酵中期具有顯著變化，而2,6-二甲氧基苯酚F5、4-乙基-2-甲氧基苯酚（4-乙基愈創(chuàng)木酚）F4、2,4-雙（1,1-二甲基乙基）苯酚F6 則主要集中在發(fā)酵后期。據(jù)研究表明，酚類化合物是在發(fā)酵過程中通過曲霉降解和酵母發(fā)酵生成，如4-乙基愈創(chuàng)木酚由阿魏酸或者香草醛經(jīng)酵母菌及細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)[30]。酚類物質(zhì)主要變化在發(fā)酵中后期，說明酚類物質(zhì)的產(chǎn)生可能基于相關(guān)酸類和醛類含量以及酵母菌或細(xì)菌的數(shù)量。

在稀醪發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)的8 種酸類物質(zhì)中具有顯著性變化的僅有2-甲基丙酸S3、乙酸S1、戊酸S5 這三種酸類，且集中在發(fā)酵后期，其他酸類的變化則較為穩(wěn)定。其中具有干酪、奶制品香味的2-甲基丙酸S3 和酸香的乙酸S1 的含量較高[25]。乙酸是由乳酸菌對檸檬酸的分解代謝形成的[31]，說明發(fā)酵后期乳酸菌的生長代謝十分旺盛，能夠柔和醬油的口感，并與醇類物質(zhì)反應(yīng)生成酯類。

酯類物質(zhì)在發(fā)酵中期具有顯著變化的是2-甲基丁酸2-苯乙酯Z15、β-苯基乙基丁酸酯Z14、乙酸2-苯乙基酯Z12、1-丙烯-2-醇乙酸酯Z2，后期則為 4-羥基丁酸甲酯Z7、丁酸乙酯Z4、3-甲基-1-丁醇乙酸酯Z9、甲基丁酸酯Z3、乙酸乙酯Z1、2-羥基丙酸乙酯Z6、苯乙酸乙酯Z13、苯乙酸甲酯Z11、2-甲基丁酸乙酯Z8 等?？梢园l(fā)現(xiàn)酯類物質(zhì)含量基本都發(fā)生了顯著變化，特別是發(fā)酵后期，說明在發(fā)酵后期具備有利于酯類形成的物質(zhì)和條件，微生物生長代謝旺盛，在酯化酶的作用下合成酯類[32]。酯化酶為胞內(nèi)酶，其作用方式為催化酵母細(xì)胞內(nèi)的活性酸一?；o酶A與醇結(jié)合形成酯或由脂肪酸和醇生物合成脂肪酸酯，如具有濃烈水果香氣的乙酸乙酯是醬油中的風(fēng)味物質(zhì)，由乙酰輔酶A與氨基酸或糖類降解后產(chǎn)生的高級醇反應(yīng)生成[33]。酯類物質(zhì)的含量豐富，能夠賦予醬油良好的風(fēng)味。

綜合以上，可以發(fā)現(xiàn)醛酮類物質(zhì)含量變化的主要在發(fā)酵前中期；醇類物質(zhì)在稀醪發(fā)酵的整個時期均有顯著變化；雜環(huán)類物質(zhì)在前中后期均有不同物質(zhì)的含量增加；酸類則是只有在發(fā)酵后期具有顯著變化，尤其是乙酸和2-甲基丙酸；酯類物質(zhì)在高鹽稀態(tài)發(fā)酵中后期呈現(xiàn)大量增長，說明增加醬油中酯類物質(zhì)的含量，可通過延長醬油高鹽稀態(tài)的發(fā)酵時間，從而提升醬油的風(fēng)味。此外，添加了紅曲霉菌的醬油發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)酯類物質(zhì)的含量和豐度均為最高，酯類作為醬油中水果香和清香的香氣主體，說明紅曲菌的添加能夠提升改善醬油風(fēng)味有著重要作用，在醬油高鹽稀態(tài)發(fā)酵過程中能夠直接起到增香作用。

3 結(jié)論

通過對50/30 μm DVB/CAR/PDMS、75 μm CAR/PDMS、65 μm DVB/PDMS三種萃取頭萃取進(jìn)行篩選試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)75 μm CAR/PDMS萃取頭對高鹽稀態(tài)紅曲醬油醬醅的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)具有較好的萃取效果。使用該萃取頭的最佳萃取條件為：添加2.5 g氯化鈉、萃取溫度50 ℃、萃取時間30 min。使用最佳萃取條件萃取下經(jīng)頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）檢測分析不同醬油間揮發(fā)性成分物質(zhì)種類及其占比發(fā)現(xiàn)，紅曲醬油中揮發(fā)性物質(zhì)種類高達(dá)58 種，其中酯類的占比和豐度最高。并對高鹽稀態(tài)紅曲醬油稀醪發(fā)酵不同時期樣品進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)醇類（14 種）、酸類（7 種）、酮類（9 種）、酯類（15 種）、酚類（6 種）、醛類（3 種）、吡嗪類（3 種）、吡咯類（1 種）、烯類（1 種）、呋喃類（2 種）和其他（4 種），共65 種物質(zhì)。

通過熱圖分析其不同時期的增長率，紅曲醬油稀醪發(fā)酵前中期是醛酮類、吡嗪、吡咯類物質(zhì)含量的生成時期；稀醪發(fā)酵中后期是酚類、酸類、酯類的顯著增加時期；僅有醇類物質(zhì)是在整個發(fā)酵期間均有某種物質(zhì)顯著增加。說明高鹽稀態(tài)發(fā)酵法，發(fā)酵時間對醬油風(fēng)味物質(zhì)的生成具有至關(guān)重要的作用。揮發(fā)類物質(zhì)中酯類物質(zhì)是含量和豐度最高的種類，證明了紅曲的添加對醬油的風(fēng)味和品質(zhì)具有顯著的增強(qiáng)和改善作用。建議下一步對發(fā)酵過程中微生物生長調(diào)節(jié)與紅曲醬油的風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性和變化通路進(jìn)行研究。