張誓偉 趙杰菲 賀顯君 喬 瑩 睢志向 宋 彥

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為記憶力下降、認(rèn)知功能障礙、精神行為異常及人格改變等，嚴(yán)重影響患者的生活。由于AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，影響因素眾多，目前對于AD的早期預(yù)防和診療尚無理想方法[1]。然而，隨著對AD發(fā)病的家族性聚集情況的研究，遺傳及基因研究逐漸受到人們的關(guān)注。miRNA是一種能夠調(diào)控蛋白表達(dá)的小分子單鏈RNA，參與胚胎發(fā)育、機(jī)體免疫、腫瘤形成以及血管性疾病的發(fā)生發(fā)展，并參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)元分化過程[2]。有研究發(fā)現(xiàn)在血管性癡呆患者血清中miR-34a水平高于對照組，并隨著癡呆程度的加重升高[3]；抑制AD轉(zhuǎn)基因小鼠中miR-34a的表達(dá)可顯著改善其焦慮障礙行為表現(xiàn)[4]。但目前關(guān)于血清中miR-34a水平與AD及認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性研究尚不多見，本研究通過比較miR-34a在AD、輕度認(rèn)知障礙(Mild cognitive impairment，MCI)及健康老人中的水平差異，探討miR-34a水平與AD和認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性。

1.資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年10月至2020年1月本院收治的AD患者60例，其中男性28例，女性32例，平均(72.63±3.03)歲；同期收集MCI患者60例，男性31例，女性29例，平均(72.4±2.89)歲。AD和MCI組納入標(biāo)準(zhǔn)：①AD符合《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊》中關(guān)于AD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，MCI符合Petersen修訂的關(guān)于MCI的診斷[5,6]；②年齡≥65歲；③臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查提示無腦梗死、腦出血及顱內(nèi)占位等可能引起認(rèn)知障礙的疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重肝、腎、心功能不全者；②病例資料不全者；③有聽覺及意識障礙等不能接受認(rèn)知功能檢測者；④既往有精神病史或已使用過治療癡呆藥物者。選擇同期來我院體檢的健康老年人(年齡≥65歲)60例作為對照組，男性36例，女性24例，平均(72.18±3.11)歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)，且所有受試者或其家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測血清miR-34a水平：抽取受試者清晨空腹?fàn)顟B(tài)下的外周靜脈血5ml，離心、收集上層血清，按照Trizol試劑盒(Invitrogen)提取血清總miRNA；采用RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板，qRT-PCR檢測miR-34a水平。以U6為內(nèi)參，反應(yīng)體系為15μl，設(shè)置PCR儀器參數(shù)為95℃、2min、40個(gè)循環(huán)，93℃、15s、30個(gè)循環(huán)，70℃、1min、30個(gè)循環(huán)。并利用CFX manager 3.0軟件對Ct值進(jìn)行分析，在通過2-ΔCt法計(jì)算miR-34a的相對表達(dá)量(ΔCt=CTmiRNA-CTU6)。

1.2.2 認(rèn)知功能及其他臨床指標(biāo)檢測：對受試者采用簡易精神狀態(tài)檢查量表(Mini-mental State Examination，MMSE)和蒙特利爾認(rèn)知評估量表(Montreal Cognitive Assessment，MoCA)進(jìn)行評定，分別從定向力、記憶力、注意力、計(jì)算力、回憶力及語言表達(dá)等幾個(gè)方面進(jìn)行評定，分值越高表示認(rèn)知功能越好。兩種量表的總分均為30分，MMSE得分≤24分、MoCA得分≤26分為存在認(rèn)知功能障礙。評估在安靜環(huán)境下進(jìn)行。

受試者血液樣本抗凝狀態(tài)下送檢驗(yàn)科，采用AU5800全自動生化分析儀(邁瑞)檢測三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)；采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián))檢測同型半胱氨酸(Hcy)水平，按照試劑盒說明進(jìn)行操作，測定其在450nm處OD值，并根據(jù)OD值計(jì)算Hcy水平。

2.結(jié)果

2.1 三組一般及臨床資料比較 三組受試者受教育水平、高血脂、TG、TC、LDL-C、Hcy水平和MMSE、MoCA評分均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；兩兩比較顯示，MCI和AD組患者血清TG、TC、LDL-C、Hcy水平和MMSE、MoCA評分均高于対照組，且AD組LDL-C、Hcy水平和MMSE、MoCA評分高于MCI組(P>0.05)。見表1。

表1 三組一般及臨床資料比較

表2 miR-34a水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.2 miR-34a表達(dá)水平比較及其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性 三組miR-34a表達(dá)水平比較發(fā)現(xiàn)：AD組(3.27±0.74)和MCI組(2.49±0.76)miR-34a的相對表達(dá)水平均顯著高于對照組(1.27±0.20)，且AD組顯著高于MCI組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。為探討miR-34a的表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，進(jìn)一步的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：血清miR-34a水平與Hcy、TG、TC水平成正相關(guān)；與MMSE、MoCA評分成負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

2.3 miR-34a診斷性能分析 分別以對照組vsMCI組、MCI組vsAD組為因變量，以miR-34a和表1中有差異的指標(biāo)為自變量分別進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，其中連續(xù)變量根據(jù)中位數(shù)轉(zhuǎn)化為二分類變量，結(jié)果顯示miR-34a可能是輕度認(rèn)知障礙發(fā)生、輕度認(rèn)知障礙進(jìn)展為AD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表3和表4。以miR-34a為自變量進(jìn)行不同組別下的ROC曲線分析，結(jié)果顯示miR-34a診斷認(rèn)知功能障礙總體、輕度認(rèn)知功能障礙及鑒別MCI和AD的性能均較好(AUC>0.7)，見圖1和表5。

圖1 miR-34a診斷AD及MCI的ROC曲線

表3 MCI的影響因素分析

表4 MCI進(jìn)展為AD的影響因素分析

表5 miR-34a診斷AD及MCI的ROC曲線參數(shù)

3.討論

隨著人口老齡化的加劇，AD患者人數(shù)逐年攀高。目前對于AD患者的診療方法主要是影像學(xué)、腦電圖及腦脊液檢查測等，但這些檢測方法的診斷特異性和敏感度仍不夠理想[7]。近年來，相關(guān)學(xué)者提出AD的發(fā)生可能與基因遺傳學(xué)有關(guān)，尋找特異性基因或RNA用于臨床輔助診斷有望提高AD診斷的效率[8]。據(jù)報(bào)道，在腦組織中約20%～40%的miRNA參與大腦的發(fā)育過程，且越來越多的研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA與神經(jīng)退行性疾病進(jìn)展密切相關(guān)[9]。miR-34a是miR-34家族的重要成員，單獨(dú)位于染色體1p36上，并參與多種生物學(xué)功能。在發(fā)育過程中，它參與調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化，神經(jīng)元成熟和凋亡等神經(jīng)發(fā)育的各個(gè)方面；在衰老過程中，miR-34a的升高與聽力喪失和老年性黃斑變性有關(guān)；在病理上，它的升高可能導(dǎo)致癲癇發(fā)作和缺血性中風(fēng)時(shí)的神經(jīng)損傷和死亡，抑制miR-34a的表達(dá)可提高神經(jīng)退行性疾病中多種神經(jīng)毒性神經(jīng)細(xì)胞的存活率，可能起到神經(jīng)保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)miR-34a在AD模型小鼠中過表達(dá)，且與小鼠記憶、學(xué)習(xí)能力受損有關(guān)，抑制miR-34a表達(dá)后小鼠的記憶障礙明顯減弱，推測其可能參與早期AD的發(fā)展[10]。也有研究表明miR-34a過表達(dá)可導(dǎo)致突觸可塑性、能量代謝和靜息狀態(tài)網(wǎng)絡(luò)活性的功能障礙，導(dǎo)致快速而深刻的記憶、執(zhí)行能力等認(rèn)知障礙和AD神經(jīng)病理進(jìn)展，提示miR-34a可能是AD的潛在治療靶點(diǎn)[11,12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)AD患者血清中miR-34a水平顯著高于對照組和MCI組，且與精神狀態(tài)評分和認(rèn)知功能評分均成負(fù)相關(guān)。

ROC曲線分析和Logistic回歸分析結(jié)果顯示，在排除了其他因素的干擾后，miR-34a是認(rèn)知功能障礙和輕度認(rèn)知障礙進(jìn)展為AD的獨(dú)立影響因素，與現(xiàn)有研究結(jié)果基本一致。另外，已有研究證實(shí)AD的發(fā)病與Hcy和血脂水平密切有關(guān)，Hcy會降低人體抗氧化和甲基化能力，導(dǎo)致認(rèn)知功能的減退，促進(jìn)輕度認(rèn)知功能障礙向AD的演變，而降低Hcy和LDL-C、TC等血脂水平則可延緩AD的進(jìn)展[13,14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCI和AD組LDL-C、Hcy、TG和TC水平均顯著高于對照組，且miR-34a與Hcy、TG和TC水平均成正相關(guān)，提示miR-34a可能通過血脂代謝等參與患者認(rèn)知功能障礙的病理進(jìn)程。

綜上所述，本研究認(rèn)為miR-34a在AD患者血清中高表達(dá)，且是AD和認(rèn)知功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，具有一定的臨床診斷價(jià)值，可能成為AD治療的潛在分子靶點(diǎn)，但miR-34a的確切作用和機(jī)制還需深入研究。