鄭學(xué)殷，李秀英*，黨華，李瑞玲

(1.廣州檢驗檢測認證集團有限公司,國家加工食品質(zhì)量檢驗中心(廣東),廣州 511447;2.SGS通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司廣州分公司,廣州 510663)

二氧化硫是國內(nèi)外允許使用的一種食品添加劑,具有護色、防腐、漂白和抗氧化的作用。果蔬原料利用二氧化硫熏蒸后,可以防止在貯藏和加工過程中發(fā)生氧化褐變或微生物污染。按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定合理使用二氧化硫不會對人體健康造成危害,但長期超限量接觸二氧化硫可能導(dǎo)致人類呼吸系統(tǒng)疾病及多組織損傷[1]。國家市場監(jiān)督管理總局在其官網(wǎng)中通告了多批二氧化硫超標(biāo)食品,其中以水果干制品居多[2-4]。文獻[5]對27種食品中二氧化硫殘留的累積風(fēng)險進行了評估,發(fā)現(xiàn)水果干類食品中的二氧化硫殘留量偏高。因此,加強對水果干制品中二氧化硫的檢測顯得尤為重要。

目前,食品中二氧化硫的檢測方法主要為滴定法,該方法能夠降低假陽性結(jié)果的概率和本身有顏色的樣品對檢測結(jié)果的影響,適用性更廣。然而,這種方法存在一些缺點:儀器的氣密性和穩(wěn)定性對結(jié)果影響較大;全玻璃蒸餾花費時間較長,且無法實現(xiàn)樣品的大批量檢測[6];碘量法以目視法判斷終點,光線條件和分析人員對顏色的敏感程度均會影響測定結(jié)果,且重復(fù)性不佳。因此,需要探索出一種高效、靈敏、可自動控制的方法來解決以上問題。

本工作用鹽酸溶液超聲處理樣品,以自動化程度更高的凱氏蒸餾法提取目標(biāo)物,用自動光度滴定法對二氧化硫含量進行測定,該方法終點檢測靈敏度高[7],重現(xiàn)性好,自動化程度高,可為水果干制品中二氧化硫的自動化分析提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

905型自動滴定儀,配6.1115.000型光度電極和Tiamo 2.5操作平臺;Vap 200型全自動凱氏蒸餾儀;MS204TS/02型分析天平。

乙酸鉛溶液:20 g·L－1。

乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液:0.5 g·mL－1。

碘標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液:0.010 10 mol·L－1。

鹽酸、乙酸鉛、無水亞硫酸鈉、可溶性淀粉均為分析純;試驗用水為三級水;芒果干、雪梨干、蘋果干等散裝水果干制品均采購于市場。

1.2 試驗方法

參考GB 5009.34－2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中二氧化硫的測定》[8]中的全玻璃蒸餾-人工滴定法,稱取5 g粉碎后的樣品置于蒸餾管中,加入水270 mL和7 mol·L－1鹽酸溶液10 mL,在90%蒸汽輸出量下超聲浸提15 min。將蒸餾管置于凱氏蒸餾儀上,在90%的蒸汽輸出量下蒸餾9 min,冷凝管置于裝有25 mL吸收液(20 g·L－1乙酸鉛溶液)的燒杯中。用少量蒸餾水沖洗與吸收液接觸的冷凝管,取下燒杯,依次加入鹽酸10 mL、10 g·L－1淀粉指示液1 mL,放入轉(zhuǎn)子,置于自動滴定儀上,滴定管應(yīng)位于湍流最大的位置,用0.010 10 mol·L－1碘標(biāo)準(zhǔn)溶液在MET(等量滴定)模式下進行滴定,設(shè)置攪拌速率為8 r·min－1,檢測波長為640 nm,信號漂移值為15 m V·min－1,一階導(dǎo)數(shù)突躍值為3 m V,用Tiamo 2.5操作平臺按照公式(1)計算樣品中的總二氧化硫量w(以SO2計,g·kg－1)。按照相同方法做樣品空白試驗。

式中:V為樣品消耗的碘標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,為m L;V0為樣品空白消耗的碘標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,m L;m為樣品質(zhì)量,g;c為碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,0.010 10 mol·L－1;0.032 為 與1 mL碘標(biāo)準(zhǔn)溶液[(c(1/2I2)＝1.0 mol·L－1)]相當(dāng)?shù)亩趸虻馁|(zhì)量,g。

2 結(jié)果與討論

2.1 滴定曲線

自動光度滴定法是利用滴定過程中反應(yīng)物或生成物在特定波長下顏色的突變引起吸光度變化的原理進行檢測,顏色變化會引起電位的突變,以此來確定滴定終點[9],本工作所得的二氧化硫的滴定曲線見圖1。

由圖1 可知:在滴定劑的體積不大于0.6 mL時,電位基本趨于穩(wěn)定;當(dāng)?shù)味▌┑捏w積為0.85 mL時,電位急劇下降?？捎玫味ㄇ€的一階導(dǎo)數(shù)確定等當(dāng)點(EP1)[10],等當(dāng)點即為滴定終點。

圖1 二氧化硫滴定曲線Fig.1 Titration curve of sulfur dioxide

2.2 基于單因素試驗的試驗條件的優(yōu)化

試驗考察了水體積(m L)和樣品質(zhì)量(g)比(液料比,x1)分別為30∶1,40∶1,50∶1,60∶1,70∶1(m L∶g),超聲浸提時間(t)分別為0,5,10,15,20 min,鹽酸溶液濃度(c)分別為2,4,6,8,10 mol·L－1,蒸汽輸出量(x2)分別為60%,70%,80%,90%,100%時對水果干制品中二氧化硫測定值的影響,結(jié)果見圖2。

由圖2可知:二氧化硫測定值均隨著液料比、超聲浸提時間、鹽酸溶液濃度和蒸汽輸出量的增加先增加后降低,當(dāng)液料比為50∶1(m L∶g)、超聲浸提時間為15 min、鹽酸溶液濃度為6 mol·L－1、蒸汽輸出量為90%時,所得二氧化硫測定值最大。因此,試驗選擇的液料比為50∶1(m L∶g)、超聲浸提時間為15 min、鹽酸溶液濃度為6 mol·L－1、蒸汽輸出量為90%。

圖2 液料比、超聲浸提時間、鹽酸溶液濃度和蒸汽輸出量對二氧化硫測定的影響Fig.2 Effects of ratio of liquid to solid,ultrasonic extracting time,concentration of HCl solution and steam output on the determination of SO2

2.3 基于響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計試驗的試驗條件的優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)曲面模型的試驗結(jié)果

基于單因素試驗結(jié)果,以芒果干為待測對象,用Design-Expert 11軟件中的響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計方案考察了超聲浸提時間、鹽酸溶液濃度、液料比、蒸汽輸出量等4個因素對二氧化硫測定值(Y)的影響,在－1,0,＋1對應(yīng)的低、中、高等3種編碼水平下[11-14],采用4因素3水平建立響應(yīng)曲面模型,結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計試驗結(jié)果Tab.1 Results of test for Box-Behnken design

表1 (續(xù))

采用方差分析(ANOVA)對表1結(jié)果進行二次多項式擬合,得到了二次多項回歸方程[公式(2)]:

對回歸方程進行顯著性檢驗,方差分析結(jié)果見表2。其中,P＞0.05,對結(jié)果影響不顯著;0.01＜P≤0.05,對結(jié)果影響顯著;P≤0.01,對結(jié)果影響極顯著。

表2 響應(yīng)曲面二次回歸模型的方差分析結(jié)果Tab.2 ANOVA results for quadratic regression model of response surface

P值通常用來檢驗變量的顯著性,也可以反映各自變量之間的交互強度[15]。由表2可知,所建模型的P值小于0.000 1,遠小于0.01,可以極顯著地表示測定值與各因素之間的關(guān)系,該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義;失擬項的P值為0.107 9,大于0.05,說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小[16];一次項t、c、x1的P值均小于0.01,說明這3個因素對測定值影響極顯著,x2的P值為0.013 9,小于0.05,說明蒸汽輸出量對測定值的影響顯著;交互項tx2、cx1和x1x2的P值均小于0.01,說明這3個交互項對測定值的影響極顯著,tc、tx1的P值位于0.01～0.05之間,說明這2個交互項對測定值的影響顯著,cx2的P值為0.950 5,大于0.05,說明這個交互項對測定值的影響不顯著;二次項t2、c2、x12和x22的P值均小于0.000 1,說明這4個二次項對測定值的影響極顯著。各因素對二氧化硫測定值的貢獻度,按照從大到小順序排列,依次為鹽酸溶液濃度、液料比、超聲浸提時間、蒸汽輸出量。

通過方差分析還可得到,模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)(r)為0.988 6,校正決定系數(shù)為0.977 2,說明測定值中有97.72%的變異來源于鹽酸溶液濃度、液料比、超聲浸提時間和蒸汽輸出量,只有1.14%的變異不能被模型解釋,說明該模型擬合度較好;預(yù)測決定系數(shù)(0.938 9)與接近,變異系數(shù)(C.V.)為2.88%,說明試驗預(yù)測值的擬合度較好,該模型可以很好地反映測定值;信噪比(Adeq Precision)為29.173 1,表明該模型具有較高的可信性。

學(xué)生化殘差是用于考察測定值相對于回歸擬合是否為異常數(shù)值[17],殘差圖的分布可以幫助判明所擬合的回歸模型是否滿足有關(guān)假設(shè),由Box-Behnken設(shè)計方案得到圖3。其中,顏色由淺入深代表二氧化硫含量由小到大變化。

圖3 殘差與預(yù)測值的數(shù)據(jù)分布圖和殘差的正態(tài)分布圖Fig.3 Data distribution of residual and predicted values and normal distribution plot of residuals

由圖3(a)可知:學(xué)生化殘差與模型預(yù)測值的數(shù)據(jù)的分布是分散無規(guī)律的,說明模型是比較理想的;由圖3(b)可知,數(shù)據(jù)沿直線分布,說明殘差的分布接近于正態(tài)分布,該模型的適用性較好。

對測定值和預(yù)測值進行線性回歸,由Box-Behnken設(shè)計方案得到圖4。其中,顏色由淺入深代表二氧化硫含量由小到大變化。

圖4 預(yù)測值與測定值的線性回歸圖Fig.4 Linear regression graph of predicted value and measured value

由圖4可知:數(shù)據(jù)靠近直線分布,且大部分的測定值落在預(yù)測值上,少部分測定值對稱分布在預(yù)測值兩側(cè),說明測定值和預(yù)測值基本一致,回歸模型的擬合度較好。

2.3.2 響應(yīng)面圖結(jié)果

響應(yīng)面分析法是常用的觀察自變量對因變量影響的方法,常用二維等高線圖和三維響應(yīng)面圖表示,可通過將兩個變量固定在中心點,在試驗范圍內(nèi)改變另兩個變量來實現(xiàn)[18-19],所得三維響應(yīng)面圖和等高線圖分別見圖5和圖6。其中,響應(yīng)面向上凸起,且曲面坡度越陡峭,說明2個因素交互作用越強;等高線圖的圓心是極值所在的區(qū)域,等高線為閉合的橢圓形,橢圓越扁,2個因素的交互性越強[20],對測定值的影響越顯著。反之,響應(yīng)面曲面坡度越平滑,等高線呈圓形,說明2個因素交互作用越弱,對測定值影響越小。

由圖5～圖6可知:按照交互作用的影響程度從大到小的順序排序,依次為超聲浸提時間與蒸汽輸出量、鹽酸溶液濃度與液料比、液料比與蒸汽輸出量、超聲浸提時間與鹽酸溶液濃度、超聲浸提時間與液料比、鹽酸溶液濃度與蒸汽輸出量,其中,前5種交互作用對二氧化硫測定值的影響較顯著,這與方差分析的結(jié)果一致。

圖5 4因素兩兩交互下的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagrams under the interaction in pairs of 4 factors

圖6 4因素兩兩交互下的等高線圖Fig.6 Contour maps under the interaction in pairs of 4 factors

2.3.3 試驗條件的確定及驗證

利用Design Expert 11.0軟件對所得二次多項回歸方程進行逐步分析,確定最佳參數(shù)組合為液料比53.508∶1(m L∶g)、超聲浸提時間15.943min、鹽酸溶液濃度6.985mol·L－1,蒸汽輸出量90.025%,在此組合下,二氧化硫預(yù)測值為0.365 g·kg－1。為了方便操作,將最佳參數(shù)組合修改成液料比54∶1(m L∶g)、超聲浸提時間15.9 min、鹽酸溶液濃度7.0 mol·L－1,蒸汽輸出量90%,在此條件下對同一樣品重復(fù)分析5 次,二氧化硫測定值為0.367 g·kg－1,與模型預(yù)測值(0.365 g·kg－1)非常接近,說明響應(yīng)面模型用于本方法試驗條件優(yōu)化的可靠性較高。

2.4 滴定試驗條件的選擇

試驗環(huán)境會通過影響信號漂移值和一階導(dǎo)數(shù)突躍(DMV)值來影響滴定終點的電位和儀器的測量精度。當(dāng)信號漂移值過高、DMV 值過小時,儀器的抗噪性能降低。加液速率過快時,易出現(xiàn)假終點,測定值偏低,反之滴定終點則會延遲,滴定時間延長,結(jié)果偏高。溶液的充分混合在滴定過程中非常重要,可通過攪拌速率來控制。當(dāng)攪拌速率太大時,溶液會產(chǎn)生氣泡,攪拌速率太小時,電極周圍的溶液不能很好地混合,速率過大或過小均會造成測定結(jié)果的不準(zhǔn)確,應(yīng)選擇合適的攪拌速率,使溶液在攪拌過程中形成小漩渦,并使滴定管位于湍流最大的位置。另外,由于光度電極對顏色的變化極為敏感,滴定劑加入的位置應(yīng)與電極的距離盡量遠,并應(yīng)根據(jù)攪拌方向放置電極和滴定頭。試驗選擇的滴定試驗條件見1.2節(jié)。

2.5 干擾試驗

乙酸是水果干制品中的一種常見揮發(fā)性有機酸,可能影響二氧化硫的測定。取已知二氧化硫含量的雪梨干和芒果干等兩種樣品,每種樣品中均加入3種不同體積的乙酸,按照試驗方法測定,計算相對誤差,所得結(jié)果見表3。

表3 干擾試驗Tab.3 Interference experiment

由表3可知,相對誤差的絕對值均不大于5%,說明樣品中所含揮發(fā)酸乙酸不干擾二氧化硫的測定。

2.6 精密度和回收試驗

按照試驗方法重復(fù)分析檸檬片、榴蓮干、香蕉片、番石榴干、蘋果干、芒果干和黃桃干等7種樣品各7次,計算測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示:測定值分別為0.757,0.296,0.464,0.225,0.313,0.366,0.088 g·kg－1,測定值的RSD 分別為0.68%,0.68%,0.58%,0.42%,0.31%,0.52%,0.86%,符合方法學(xué)精密度的要求。

稱取0.500 g亞硫酸鈉,溶于0.5 g·mL－1乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液500 mL 中,緩慢搖勻,放置2～3 h,按照文獻[21]的方法對其含量進行標(biāo)定,以二氧化硫計,其標(biāo)定值為394 mg·L－1。在黃桃干、百香果干、荔枝干、雪梨干和芒果干等5種樣品中加入亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液1,2,3,4,5 mL,對應(yīng)的加標(biāo)量分別為0.079,0.158,0.236,0.315,0.394 g·kg－1,按照試驗方法測定,所得結(jié)果見表4。

表4 回收試驗結(jié)果Tab.4 Results of test for recovery

由表4 可知,二氧化硫的回收率為94.3%～99.7%。

2.7 方法比對

本法用于分析10種樣品,并同全玻璃蒸餾器-人工滴定法(國家標(biāo)準(zhǔn)方法)[8]進行比對,結(jié)果見表5。

由表5可知,2種方法測定值基本一致,本法的測定值略高于國家標(biāo)準(zhǔn)方法的。可能原因:凱氏蒸餾儀的蒸汽輸出量穩(wěn)定可控,蒸餾效果好于全玻璃蒸餾器;光度電極對顏色的判斷更靈敏,可有效避免人肉眼觀察指示劑的變色區(qū)域時產(chǎn)生的視覺誤差[22];該方法對滴定終點的判斷是由儀器生成的滴定曲線的一階導(dǎo)數(shù)確定的,等當(dāng)點與終點的誤差非常小。對2種方進行t檢驗,所得P值為0.25,大于0.05,說明在95%的置信水平下,2種方法沒有顯著性差異,符合檢測要求。

表5 方法比對結(jié)果Tab.5 Results of method comparison g·kg－1

本工作分別采用單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計試驗優(yōu)化了液料比、超聲浸提時間、蒸汽輸出量和鹽酸溶液濃度等條件,采用凱氏蒸餾-自動光度滴定法測定水果干制品中二氧化硫含量,該方法解決了目前在亞硫酸鹽含量測定方法中自動化程度低、蒸餾環(huán)境易被污染和滴定終點難判斷等問題,全程皆由儀器控制、等當(dāng)點判斷準(zhǔn)確、使用方便、測定快速,精密度和準(zhǔn)確度均較好,可用于水果干制品中二氧化硫含量的測定。