徐 燕， 馮 濤， 儲(chǔ) 炬

（1. 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2. 國(guó)藥集團(tuán)威奇達(dá)藥業(yè)有限公司，山西大同 037300）

頭孢菌素C（CPC）被Abraham和Newton 兩位學(xué)者從頂頭孢霉（Acremonium chrysogenum）培養(yǎng)液中分離鑒定[1-2]，隨后，以CPC 為原料的頭孢菌素類抗生素逐漸成為世界抗生素市場(chǎng)的重要一員。該類抗生素屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，具有廣譜抗菌性，且相較于青霉素，其療效更好，安全性更高，副作用更少。此外，由于CPC 中二氫噻嗪環(huán)與β-內(nèi)酰胺環(huán)相連的特殊母核結(jié)構(gòu)，使其具有更好的青霉素酶耐受性[3]。

CPC 去除支鏈后得到的7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）是各類頭孢菌素衍生藥物的起點(diǎn)化合物，常通過發(fā)酵手段獲得。在發(fā)酵過程中雖常含有青霉素N（PEN）、脫乙酰氧頭孢菌素C（DAOC)等中間產(chǎn)物，但脫乙酰頭孢菌素C（DCPC）為主要副產(chǎn)物。DCPC 結(jié)構(gòu)與性質(zhì)和CPC極為相似，兩者均為氨基酸，它常以內(nèi)銨鹽形式存在，發(fā)酵生產(chǎn)中DCPC 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為CPC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的15%～20%[4]。在現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝中，DCPC 雖能夠與主產(chǎn)物CPC 進(jìn)行分離，但其在余液中的大量殘留會(huì)造成環(huán)境污染?？股氐拈L(zhǎng)期累積，會(huì)使周圍土壤微生物與動(dòng)植物生長(zhǎng)進(jìn)化均受到影響，相關(guān)聯(lián)的上下游生物也會(huì)受到干擾，從而影響該地區(qū)的生態(tài)平衡。雖然目前有許多學(xué)者對(duì)CPC 廢液中副產(chǎn)物的再利用進(jìn)行了大量的研究，但是由于可操作性與經(jīng)濟(jì)效益等問題，真正應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的還少之又少。

DCPC 的累積有兩方面原因：一方面，頂頭孢霉自身DCPC 乙酰轉(zhuǎn)移酶（DCPC-AT）啟動(dòng)子強(qiáng)度不足，轉(zhuǎn)錄量低，使DCPC 無(wú)法有效轉(zhuǎn)化為CPC，成為生產(chǎn)過程中的限制性步驟之一[5]；另一方面，頂頭孢霉Ⅷ染色體上含有CPC 乙酰水解酶基因（cahB），菌體經(jīng)72 h 培養(yǎng)后可編碼表達(dá)一個(gè)1.4 kb 的單鏈轉(zhuǎn)錄子，翻譯出的乙酰水解酶（CPC-AH）可將已有的CPC 水解為DCPC，CPC-AH 酶活性雖然從120 h 開始下降，但144 h 仍然能觀察到活性[6]。

近年來(lái)，原為細(xì)菌和古細(xì)菌的獲得性自我免疫預(yù)防機(jī)制CRISPR/Cas9 系統(tǒng)[7]在基因編輯領(lǐng)域大放異彩，在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，已實(shí)現(xiàn)多基因[8-9]、多位點(diǎn)[10]、長(zhǎng)片段（大于30 kb）[11]的成功編輯，在米曲霉（Aspergillus oryzae）[12]、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）[13]、里 氏 木 霉（Trichoderma reesei）[14]等真菌中有多種應(yīng)用，極大提高了真菌中基因編輯效率。頂頭孢霉屬于半知菌門真菌，與其他絲狀真菌相比，其生長(zhǎng)周期長(zhǎng)且無(wú)有性生殖階段。本實(shí)驗(yàn)室首先在頂頭孢霉野生型CGMCC3.3795中構(gòu)建了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，并對(duì)聚酮合酶相關(guān)基因（sorA、sorB）分別進(jìn)行了敲除，編輯效率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)方法[15]。

本研究利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，對(duì)頂頭孢霉發(fā)酵過程中雜質(zhì)DCPC 累積問題進(jìn)行了定向改造，構(gòu)建基因cahB缺陷菌株與基因cefG過表達(dá)菌株，以期降低DPCP 雜質(zhì)含量，提高CPC 產(chǎn)量與質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 頂頭孢霉（Acremonium chrysogenum）1-D1 工業(yè)菌株、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。真菌表達(dá)質(zhì)粒pAN7-1 由本實(shí)驗(yàn)室保存，含RGR（Ribozyme-gRNA-Ribozyme）結(jié)構(gòu)質(zhì)粒pUC57 由華大基因合成，含CRISPRCas9 基因編輯系統(tǒng)質(zhì)粒pAN7-sorA 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建與保存。

1.1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法 麥芽汁培養(yǎng)基（用于工業(yè)頂頭孢霉菌株斜面培養(yǎng)）、種子培養(yǎng)基（用于頂頭孢霉菌株種子培養(yǎng)）、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（用于頂頭孢霉菌株發(fā)酵），配方與培養(yǎng)方法參見文獻(xiàn)[16]，并略有調(diào)整（種子培養(yǎng)基pH 為7.2）。原生質(zhì)體培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)化方法參見文獻(xiàn)[14]。

1.1.3 儀器與檢測(cè)方法 利用高效液相色譜儀（日本島津有限公司LC-20T）對(duì)CPC 和DCPC 進(jìn)行檢測(cè)。CPC 檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[16]。DCPC 檢測(cè)：流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇與磷酸鹽的混合溶液（體積比為3∶97），流速為1 mL/min，等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)時(shí)間35 min。

1.1.4 酶與試劑 質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒：Axygen 公司；真菌基因組抽提試劑盒、真菌RNA 提取試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；Evo M-MLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR? Green Premix qPCR 試劑盒：湖南艾科瑞生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶：NEB 公司；一步克隆試劑盒、Phanta酶等PCR 酶：Vazyme 公司；CPC 標(biāo)準(zhǔn)品與DCPC 標(biāo)準(zhǔn)品（含量未知）由國(guó)藥集團(tuán)山西威奇達(dá)藥業(yè)有限公司饋贈(zèng)。四丁基氫氧化銨（Tetrabutylammonium Hydroxide）：色譜級(jí)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。流動(dòng)相磷酸鹽（用于CPC 與DCPC 檢測(cè)）：850 mL超純水中加入0.8 g NaH2PO4，攪拌混勻后，用四丁基氫氧化銨調(diào)節(jié)pH 至7.3，0.45 μm 濾膜抽濾除雜，超聲30 min 去除氣泡。

1.1.5 引物合成與測(cè)序 測(cè)序、引物合成均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。表1 為引物列表，其中大寫字母為模板質(zhì)粒pUC57 中RGR 特異性結(jié)構(gòu)的骨架。

表1 引物列表Table 1 List of primers

續(xù)表1

1.2 sgRNA 設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建

經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，得到頂頭孢霉野生型（ ATCC11550） CPC 乙 酰 水 解 酶（ CPC-AH） 基 因cahB（ACRE_083500），通過與工業(yè)菌1-D1 全基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，找到工業(yè)菌中相對(duì)應(yīng)的基因序列（GME1727_g）。通過sgRNA 設(shè)計(jì)網(wǎng)站（https://gt-scan.csiro.au/submit/）設(shè)計(jì)靶目標(biāo)序列5’-gcggcaagaccggccacatgAGG-3 ’ 。 設(shè) 計(jì) 引 物 sgcahB-1、 sgcahB-2、sgcahB-3、sgcahB-4（見表1）。以pUC57 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，回收得到長(zhǎng)度分別為84 bp 與204 bp的兩片段，將片段融合PCR 后獲得可識(shí)別cahB基因的特異性sgRNA 片段cahB-sgRNA。

將質(zhì)粒pAN7-sorA 雙酶切（HindIII、SpeI）膠回收含Cas9 蛋白表達(dá)盒的大片段質(zhì)粒骨架，與cahBsgRNA 片段一步克隆連接，構(gòu)建pAN7-cahB質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)大腸DH5α感受態(tài)，挑取單菌落，液體培養(yǎng)后提質(zhì)粒送測(cè)序。載體pAN7-cahB 構(gòu)建電泳圖見圖1 所示。

圖1 pAN7-cahB 構(gòu)建電泳圖Fig. 1 Electrophoretogram of pAN7-cahB construction

1.3 cefG 基因表達(dá)盒與Donor DNA 構(gòu)建

依據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中cefG序列（GI: 672 794 352），比對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已有測(cè)序結(jié)果，獲得工業(yè)菌株1-D1中cefG序列，設(shè)計(jì)引物，以1-D1 基因組為模板擴(kuò)增，獲得cefG基因片段，見圖2。由圖可見，以pAN7-1為模板，設(shè)計(jì)反向引物（R-pAN7-1-F，R-pAN7-1-R），PCR 得到含啟動(dòng)子與終止子的反向骨架PgpdApAN7-Ttrpc，采用一步克隆的方法將骨架與cefG基因片段連接，構(gòu)建cefG表達(dá)質(zhì)粒pAN7-1-cefG，進(jìn)行大腸桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化，挑單菌落PCR 初步驗(yàn)證后，提質(zhì)粒測(cè)序。

圖2 pAN7-1-cefG 構(gòu)建電泳圖Fig. 2 Electrophoretogram of pAN7-1-cefG construction

Donor DNA 構(gòu)建流程與原理見圖3。首先，依據(jù)1-D1 測(cè)序結(jié)果，選取cahB基因上下游長(zhǎng)度為1 000 bp左右片段作為同源臂，PCR 擴(kuò)增獲得同源臂B1、B2。以Split-Marker 重組技術(shù)為原理，設(shè)計(jì)引物（cahB-PT-F1，cahB-PT-R1）、（cahB-PT-F2，cahB-PTR2），將同源修復(fù)片段分上下游片段進(jìn)行導(dǎo)入。將質(zhì)粒上PgpdA-cefG-Ttrpc 表達(dá)盒分兩部分進(jìn)行擴(kuò)增得到PgpdA-cefG（2 286 bp）、cefG-TtrpC（2 370 bp），中間含200 bp重疊區(qū)。電泳條帶見圖4（a）。采取融合PCR 方式與上下游同源臂分別連接，獲得Donor DNA（B1-PgpdA-cefG、cefG-TtrpC-B2），見圖4（b）。

圖3 Donor DNA 構(gòu)建流程圖Fig. 3 Donor DNA generation flow chart

圖4 Donor DNA 構(gòu)建電泳圖Fig. 4 Electrophoretogram of donor DNA construction

1.4 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建完成的pAN7-cahB 質(zhì)粒與同源修復(fù)片段（B1-PgpdA-cefG、cefG-TtrpC-B2）進(jìn)行頂頭孢霉原生質(zhì)體共同轉(zhuǎn)化，在PEG 介導(dǎo)下，將外源質(zhì)粒與同源修復(fù)表達(dá)盒導(dǎo)入菌體內(nèi)，進(jìn)行特異性打靶與同源修復(fù)。轉(zhuǎn)化時(shí)，外源質(zhì)粒的質(zhì)量為8～10 μg，pAN7-cahB 質(zhì)粒、同源修復(fù)片段（B1-PgpdA-cefG）和同源修復(fù)片段（cefGTtrpC-B2）質(zhì)量比為4∶1∶1，總體積不超過20 μL（當(dāng)無(wú)需同源修復(fù)片段協(xié)同作用時(shí)，外源質(zhì)粒所需量不變但總體積不超過10 μL）。當(dāng)外源核酸物質(zhì)與原生質(zhì)體輕柔混勻后，將該體系與上層培養(yǎng)基混合后倒至含有下層轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的平板中，28 ℃培養(yǎng)10～12 d，待轉(zhuǎn)化板長(zhǎng)出半透明的白色菌落，使用已滅菌牙簽轉(zhuǎn)移至麥芽汁平板（潮霉素抗性：150 μg/mL），28 ℃培養(yǎng)7 d。轉(zhuǎn)化步驟見圖5。

圖5 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)流程圖Fig. 5 Flow chart of protoplast transformation experiment

1.5 轉(zhuǎn)化子篩選驗(yàn)證

1.5.1 Ac-ΔcahB 驗(yàn)證方法 在PAM 序列上下游500～1 000 bp 處設(shè)計(jì)引物（C-veri-F，C-veri-R），以基因組為模板進(jìn)行PCR，獲得的片段（1 500 bp）通過T7EI 酶切來(lái)初步驗(yàn)證是否與基因組有錯(cuò)配堿基，再進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果見圖6。轉(zhuǎn)化子測(cè)序結(jié)果為5’-gcggcaagaccggccac--gAGG-3’，將其與原基因組進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)PAM 序列（AGG）的上游有2 個(gè)堿基缺失。將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)傳代至第5 代基因組時(shí)堿基缺失仍然存在，說明采用單質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行敲除的菌株，其遺傳穩(wěn)定性良好，沒有產(chǎn)生回復(fù)突變。

圖6 Ac-ΔcahB 轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證結(jié)果Fig. 6 Ac-ΔcahB transformant verification results

單質(zhì)粒轉(zhuǎn)化在驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)，部分轉(zhuǎn)化子無(wú)法進(jìn)行PCR 獲得驗(yàn)證片段，這可能是由于Cas9 蛋白切割造成的雙鏈斷裂所引發(fā)的非同源性末端接合（NHEJ），導(dǎo)致基因組其他部分的大片段插入與缺失，使驗(yàn)證引物無(wú)法與基因組匹配。但是由于其插入與缺失長(zhǎng)度的不確定性，無(wú)法很好通過調(diào)整引物與片段長(zhǎng)度解決，故采取單質(zhì)粒與Donor DNA 共轉(zhuǎn)方式以較好解決突變株驗(yàn)證問題。

1.5.2 Ac-ΔcahB:cefG 驗(yàn)證方法 轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證原理見圖7。首先，以C1-1、C1-2 為引物擴(kuò)增靶基因序列，對(duì)照組1-D1 有擴(kuò)增片段，實(shí)驗(yàn)組應(yīng)無(wú)擴(kuò)增片段；而以C2-1、C2-2 為引物擴(kuò)增同源修復(fù)片段中cefG基因表達(dá)盒的部分序列，對(duì)照組1-D1 應(yīng)無(wú)擴(kuò)增片段，實(shí)驗(yàn)組應(yīng)有擴(kuò)增片段；再以C3-1、C3-2、C4-1、C4-2 為引物分別擴(kuò)增上游同源臂B1 與表達(dá)盒啟動(dòng)子部分、表達(dá)盒終止子與下游同源臂B2 部分，對(duì)照組1-D1應(yīng)無(wú)擴(kuò)增片段，而實(shí)驗(yàn)組應(yīng)有擴(kuò)增片段。最后用C3-1、C4-2為引物擴(kuò)增時(shí)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組條帶長(zhǎng)度有明顯差異，電泳結(jié)果見圖8。

圖7 Ac-ΔcahB::cefG 驗(yàn)證原理圖Fig. 7 Ac-ΔcahB::cefG verification principle diagram

圖8 Ac-ΔcahB::cefG PCR 驗(yàn)證圖Fig. 8 Ac-ΔcahB::cefG PCR verification chart

1.6 RNA 提取以及RT-PCR（Red Time Quantitative PCR）分析相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平

取培養(yǎng)72、96 h 后的頂頭孢霉改造菌株Ac-ΔcahB、Ac-ΔcahB::cefG 與出發(fā)菌株1-D1 的發(fā)酵液，去盡上清并用DEPC（焦碳酸二乙酯）水洗滌3 次后，進(jìn)行液氮研磨，按照真菌RNA 提取試劑盒說明書要求進(jìn)行RNA 提取。確認(rèn)RNA 質(zhì)量與濃度后，使用Evo M-MLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以此為模版，以cefG-F1、cefG-R1 為引物，使用SYBR? Green Premix qPCR 試劑盒進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。

2 結(jié)果與討論

2.1 出發(fā)菌株與突變菌株的CPC 產(chǎn)量比較

將突變株Ac-ΔcahB、Ac-ΔcahB::cefG 與對(duì)照工業(yè)菌株1-D1 進(jìn)行168 h 的液體搖瓶發(fā)酵，對(duì)CPC產(chǎn)量與雜質(zhì)DCPC 產(chǎn)量進(jìn)行比較研究。CPC 產(chǎn)量如圖9所示，突變株Ac-ΔcahB的CPC產(chǎn)量為4 665 μg/mL，出發(fā)菌株的CPC 產(chǎn)量為4 578 μg/mL，兩者發(fā)酵水平相接近。而突變株Ac-ΔcahB::cefG 的CPC 產(chǎn)量為6 072 μg/mL，相較于出發(fā)菌株，總體提高了32.6%，差異顯著（p=0.025 9）。以上結(jié)果可推測(cè)，插入強(qiáng)化表達(dá)的cefG基因可使DCPC 得到有效轉(zhuǎn)化，減少了菌體中的積累，在降低雜質(zhì)的同時(shí)進(jìn)一步提高了CPC 的產(chǎn)量。

圖9 出發(fā)菌株與突變株CPC 產(chǎn)量比較Fig. 9 CPC production comparison of starting strain and mutant strain

cahB基因是CPC 乙酰水解酶基因，可將CPC 水解成為無(wú)經(jīng)濟(jì)價(jià)值的DCPC。但是在此結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，敲除該基因后CPC 并未達(dá)到預(yù)期中明顯提高的效果，這可能由于水解的CPC 在總產(chǎn)量中所占比重比較小。有學(xué)者對(duì)CPC 乙酰水解酶進(jìn)行了酶動(dòng)力學(xué)反應(yīng)研究，結(jié)果表明，純化至均質(zhì)的酶蛋白與CPC 的親和力不高（Km=33.7 mmol/L），同時(shí)其酶活性在發(fā)酵至120 h 時(shí)開始逐漸下降[6]。底物CPC 濃度較低時(shí)，與乙酰水解酶結(jié)合轉(zhuǎn)化的效率較低，水解能力較弱，因乙酰水解酶減少的CPC 在總產(chǎn)量中所占比重比較小，故敲除后CPC 產(chǎn)量沒有明顯提升。此外，在對(duì)基因組進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌體中有可能存在其他CPC 水解酶，如GME4736_g 與GME1825_g（圖10），其分別注釋為堿性蛋白酶（Alkaline proteinase）與角質(zhì)層降解蛋白酶（Cuticle-degrading protease），均具有絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性，而cahB與枯草芽孢桿菌的絲氨酸蛋白質(zhì)家族基因具有高同源性。相較于cahB，這些注釋為絲氨酸家族的蛋白質(zhì)基因?qū)PC 的水解可能起主導(dǎo)作用。

圖10 CPC 合成與分解過程的相關(guān)基因Fig. 10 Genes involved in the process of CPC synthesis and decomposition

2.2 出發(fā)菌株和突變菌株的DCPC 產(chǎn)量比較

圖11 出發(fā)菌株與突變株發(fā)酵液高效液相色譜圖Fig. 11 HPLC of the fermentation broth of starting strain and mutant strain

圖12 出發(fā)菌株與突變株DCPC 的含量比較Fig. 12 DCPC content comparison of starting strain and mutant strain

2.3 基因轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定

以出發(fā)菌株1-D1 為對(duì)照，提取發(fā)酵72 h 與96 h的菌體RNA 進(jìn)行熒光定量PCR（RT-qPCR）分析。分別以菌株中γ-actin 為內(nèi)參基因進(jìn)行矯正，對(duì)DCPC乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cefG進(jìn)行表達(dá)量測(cè)定，結(jié)果見圖13所示。在頂頭孢霉中，DCPC 乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cefG內(nèi)源性啟動(dòng)子較弱，基因表達(dá)強(qiáng)度較低一直是CPC 生產(chǎn)過程中的限制性步驟。在Ac-ΔcahB::cefG菌株中，強(qiáng)啟動(dòng)子PgpdA提高了cefG表達(dá)量，且上調(diào)倍數(shù)高達(dá)5 倍。DCPC 乙酰轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄量的提升可能增加了菌體內(nèi)乙酰轉(zhuǎn)移酶的含量，從而提高了菌體對(duì)中間產(chǎn)物DCPC 的轉(zhuǎn)化效率，促進(jìn)了CPC 合成。

圖13 DCPC 乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cefG 相對(duì)表達(dá)量測(cè)定Fig. 13 Determination of cefG expression level of DCPC acetyltransferase gene

3 討 論

頭孢菌素類抗生素因其毒性低、抗菌譜廣、作用效果好等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床治療中，而CPC 作為頭孢菌素類抗生素的重要原料，其生產(chǎn)菌株頂頭孢霉的發(fā)酵卻常有中間產(chǎn)物與類似物作為雜質(zhì)殘留，對(duì)CPC 產(chǎn)量以及分離純化造成影響。

本文運(yùn)用CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建了Ac-ΔcahB 菌株，并通過結(jié)合Donor DNA，優(yōu)化了敲除效率，構(gòu)建了Ac-ΔcahB::cefG 菌株。cahB基因的敲除雖不能有效提高CPC 產(chǎn)量，但是從適宜種齡以及平板培養(yǎng)等其他生長(zhǎng)狀況而言，該基因的敲除對(duì)菌體生長(zhǎng)并沒有過多影響?；蛟S，相較于以往隨機(jī)插入的過表達(dá)方法，將cahB基因作為定點(diǎn)整合位點(diǎn)，是一個(gè)便于驗(yàn)證的不錯(cuò)選擇。此外，在對(duì)基因組進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌體中有可能存在其他CPC 水解酶，如堿性蛋白酶（Alkaline proteinase）與角質(zhì)層降解蛋白酶（Cuticle-degrading protease），均具有絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性，并且cahB與枯草芽孢桿菌的絲氨酸蛋白質(zhì)家族基因具有高同源性。相較于cahB，可能這些注釋為絲氨酸家族的蛋白質(zhì)基因?qū)PC 的水解起著主導(dǎo)作用。插入由強(qiáng)啟動(dòng)子PgpdA過表達(dá)的cefG基因，使突變菌株Ac-ΔcahB::cefG 在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量提高了5 倍，并且在CPC 生產(chǎn)與DCPC 雜質(zhì)方面較出發(fā)菌株均差異顯著，既使CPC 產(chǎn)量提高了32.6%，又使DCPC含量控制在6.81%。此外，發(fā)酵培養(yǎng)基的有效利用，提高了經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)由于DCPC 含量的降低減少了廢液中抗生素的殘留，從而減小了廢液排放對(duì)環(huán)境的影響。