劉翠翠， 李友元， 王永紅

（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

生物柴油是由動植物油脂、微生物油脂及一些垃圾油脂等可再生物質通過酯交換過程得到的一種環(huán)境友好型燃料[1-2]。微生物油脂具有生產周期短、可連續(xù)生產、可規(guī)?；米匀唤绲呢S富資源等特點，脂肪酸組成也易通過基因工程手段進行改造，因而微生物油脂成為第三代生物柴油重要的原料來源[3]。本實驗室前期利用食品級安全菌株谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum）通過理性的基因改造手段獲得了產油菌株CT14，顯示了谷氨酸棒桿菌作為微生物油脂生產菌的潛力，有必要進一步研究其作為產油微生物的宿主菌對微生物油脂的合成與調控機制[4]。

甘油-3-磷酸酰基轉移酶（GPAT）催化3-磷酸甘油和脂肪?；o酶A 生成溶血磷脂酸（LPA），是甘油三酯和甘油磷脂合成的第一步反應且可能為限速步驟[5]，在油脂的合成過程中起重要作用[6]。研究表明，在集胞藻PCC6803 中，GPAT 的編碼基因被驗證是該菌油脂合成的重要基因[7]。Paya 等[8]在酵母中過表達向日葵gpat9(Hagpat9)基因，使酵母三?；视停═AG）總量增加，并且脂肪酸組分也發(fā)生了改變。然而，KEGG 數據庫顯示，在谷氨酸棒桿菌的基因組中沒有明確標注的GPAT 的功能基因。Holder 等[9]通過比較谷氨酸棒桿菌與其他產油微生物的功能基因組后也指出谷氨酸棒桿菌缺少GPAT 的功能基因（EC 2.3.1.15）。但正如文獻[4]中所指出的GPAT 是微生物細胞膜脂質合成途徑中的重要酶，谷氨酸棒桿菌能正常生長，說明谷氨酸棒桿菌肯定存在類似GPAT功能的蛋白。為了深入理解谷氨酸棒桿菌的油脂合成途徑，進一步提升產油脂性能，有必要研究谷氨酸棒桿菌中GPAT 的功能基因。

本文首先基于文獻和生物信息學技術預測了CorynebacteriumglutamicumATCC13032 編碼GPAT的多個候選功能基因，并選擇其中之一cg2777基因進行后續(xù)驗證；然后利用基因工程手段敲除及過表達谷氨酸棒桿菌的GPAT編碼cg2777，結合發(fā)酵分析鑒定并研究谷氨酸棒桿菌中GPAT 的功能基因，為深入解析谷氨酸棒桿菌的油脂合成分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和引物

本實驗中所使用的菌株、質粒和引物均列于表1。

表1 本文所用菌株、質粒和引物的基因型和來源Table 1 Genotype and source of strains, plasmids and primers in this work

1.2 試劑和培養(yǎng)基

限制性內切酶、T4 連接酶、Gibson 組裝試劑盒、Phusion 超保真DNA 聚合酶、去磷酸化酶，均購于NEB（北京）有限公司；質粒小提試劑盒、DNA 純化回收試劑盒，購于TIANGEN 生物科技公司；X-gal、山梨醇、萘啶酮酸、硫酸卡那霉素，購于上海生工生物工程股份有限公司；牛腦心浸粉，購于美國BD 公司；其余試劑為進口或國產分析純。

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基、牛心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHIS）、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基，見參考文獻[4]。

1.3 谷氨酸棒桿菌的GPAT 生物信息學分析

使用KEGG 數據庫和NCBI 網站進行GPAT 的編碼基因的尋找；利用MEGA-X 軟件進行同源序列比對分析；利用TMHMM Server 2.0 在線軟件預測分析GPAT基因編碼的蛋白質的跨膜區(qū)，TMHMM 軟件可以區(qū)分外周膜蛋白和內在膜蛋白。

1.4 方法

1.4.1 一般操作 DNA 片段的回收、酶切、純化、連接，大腸桿菌質粒抽提和轉化，瓊脂糖凝膠電泳，感受態(tài)制備與轉化等分子生物學操作均參見文獻[4]。

1.4.2 重組質粒pZ8-TAG4-cg2777 的構建與轉化以谷氨酸棒桿菌基因組DNA 為模板，用引物對cg2777-FOR/REV 擴增基因cg2777，其片段大小為974 bp。將PstⅠ單酶切載體質粒pZ8-TAG4 和聚合酶鏈式反應(PCR)目的片段純化后利用Gibson 無縫克隆試劑盒連接，獲得重組質粒pZ8-TAG4-cg2777。將重組質粒pZ8-TAG4-cg2777 通過電轉化方法轉到谷氨酸棒桿菌CG14。在含50 μg/mL 卡那霉素的牛心浸液肉湯或瓊脂平板上篩選，并通過菌落聚合酶鏈式反應（PCR）進行驗證。

1.4.3 重組質粒pK18mobsacB-cg2777 的構建與轉化

以谷氨酸棒桿菌基因組DNA 為模板，用引物對cg2777-D1/D2 擴增基因cg2777的上游片段62 bp，用引物對cg2777-D3/D4 擴增基因cg2777的下游片段547 bp。由于兩段PCR 產物含有20 bp 左右的同源序列，因此將兩段PCR 產物切膠回收，等量混合作為模板，以cg2777-D1/D4 為引物進行重疊PCR。最終的PCR 產物通過XbaⅠ和SbfⅠ雙酶切后與相同酶切的質粒pK18mobsacB 進行連接，獲得重組質粒pK18mobsacB-cg2777?；谕粗亟M方法對基因cg2777進行敲除[10]。通過電轉化方法將敲除質粒pK18mobsacB-cg2777 轉到谷氨酸棒桿菌CG14。在含50 μg/mL 卡那霉素的BHIS 平板上篩選已產生第1 次重組的卡那霉素抗性克隆。隨機挑取轉化子接種到LB 培養(yǎng)基中。30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h 后涂布于含10%（質量分數）蔗糖的BHIS 平板上，篩選已產生第2 次重組的克隆。將轉化子分別轉接到含50 μg/mL卡那霉素的平板和10%（質量分數）蔗糖的平板上，驗證轉化子的卡那霉素和蔗糖抗性，其中具有蔗糖抗性，且對卡那霉素敏感的克隆即為已發(fā)生了敲除的克隆，并通過菌落PCR 進行驗證。

1.4.4 分析方法 采用上海儀電721G 分光光度計測定菌體濃度；用微量pH 計直接測定pH 值。菌體干重測定：取干燥不帶蓋子的15 mL 離心管若干稱重（需要用分析天平）；稱取合適時間的發(fā)酵菌液5 mL并在3 500 r/min 下離心10 min 與上清液分開，在菌體中加3 mL 超純水重懸；液氮速凍后于四環(huán)凍干儀中干燥48 h（需要提前預冷，使溫度降至-50 ℃以下）；用分析天平稱重，減去離心管質量即為菌體干重。胞內外脂肪酸測定：采用氣相色譜法測定，色譜條件：色譜柱為HP-5，柱箱溫度220 ℃，檢測器溫度280 ℃，進樣器溫度250 ℃，進樣口分流體積比20∶1，進樣體積1 μL。

2 結果與分析

2.1 GPAT 的功能基因預測

如前文所述，來自于KEGG 數據庫和其他研究者的研究發(fā)現，在谷氨酸棒桿菌ATCC13032 的基因組中沒有明確標注的GPAT 的功能基因。因此，常規(guī)的同源多序列搜索未能發(fā)現有效的候選序列，必須采用其他的間接搜索方法。

首先，對模式生物大腸桿菌的GPAT 蛋白研究發(fā)現，其結合底物3-磷酸甘油可能依賴于HXXXXD序列（“X”代表任意氨基酸）。前期嘗試使用一級序列進行直接預測，使用UniProt 蛋白質數據庫上CorynebacteriumglutamicumATCC 13032 的蛋白質組進行分析，對所有序列進行HXXXXD 搜索，得到了接近1 100 條含有HXXXXD 的序列，由于HXXXXD單獨一個模塊復雜性較低，可能的序列以及錯誤匹配較多，工作量巨大，先行放棄這一策略。

GPAT 是微生物細胞膜脂質合成途徑中的重要酶，因此我們大膽猜測GPAT 蛋白定位是在細菌內膜上。M?ker 等[11]通過研究谷氨酸棒桿菌的MtrAMtrB 二元信號轉導系統(tǒng)，發(fā)現攜帶有mtrAB 雙缺失的谷氨酸棒桿菌突變體細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞變性拉長到野生型菌株的3 倍，說明缺失株可能作用在細胞壁上，導致菌株不能正常進行細胞分裂，進一步研究發(fā)現mtrAB 缺失株對作用于細胞壁的抗生素有更高的靈敏度，包括青霉素、萬古霉素和溶菌酶，這表明突變體的細胞壁有損傷，除了功能明確的蛋白酶、脂酶受影響以外，還有一部分功能不明確的基因，其中假定蛋白CG2777（NCgl2434）是假定膜蛋白。Brocker 等[12]進一步考察了與MtrA-MtrB 二元轉導系統(tǒng)有關的目標基因等信息，共發(fā)現4 種(CG0896、CG2096、CG2777、CG3254)未知功能的假定膜蛋白受影響，其中后3 種受到抑制效果的蛋白中，CG2777受抑制效果最大，因此本文選擇CG2777 蛋白編碼基因cg2777進行下一步分析與驗證。

利用MEGA-X 軟件對谷氨酸棒桿菌的cg2777基因與9 種其他來源GPAT 的基因[9]進行多序列比對分析，發(fā)現谷氨酸棒桿菌的cg2777基因序列前后缺失較長片段，在中部存在多處插入和缺失（圖1），這也是常規(guī)多序列同源搜索無法找到該序列的原因。使用TMHMM 跨膜預測分析軟件分析目標蛋白CG2777的跨膜結構，如圖2 所示。根據預測結果分析目標蛋白為插膜蛋白，具有4 個跨膜結構域，氨基酸位置分別在92～129、130～153、186～221 和264～297。

圖1 cg2777 與GPAT 的同源基因多序列比對Fig. 1 Multi-sequence comparison between cg2777 and homologous GPAT genes

圖2 目標蛋白跨膜預測Fig. 2 Target protein transmembrane prediction

2.2 重組質粒的構建

將上述重組質粒分別通過電激轉化到谷氨酸棒桿菌CG14 感受態(tài)細胞得到重組菌株CT14+cg2777和CT14Δcg2777。將重組菌株在以葡萄糖為唯一碳源下進行搖瓶發(fā)酵驗證，并以CG14 菌株作為對照菌株，研究菌株GPAT 功能基因改造對其生長情況、胞內外脂肪酸合成的影響。

2.2.1 質粒pZ8-TAG4-cg2777 的構建 基因cg2777過表達引物序列如表1 所示，引物中的小寫字母為引物間的重疊互補序列，大寫加粗部分為谷氨酸棒桿菌核糖體結合位點（RBS）序列。以Corynebacterium glutamicumATCC13032 基因組為模板，利用引物對cg2777-FOR 和cg2777-REV 擴增基因cg2777，其片段大小為974 bp。將PstⅠ單酶切載體質粒pZ8-TAG4 和PCR 目的片段純化后利用Gibson 無縫克隆試劑盒連接轉化大腸桿菌感受態(tài)，利用驗證引物對PZ8-T2/T3 進行菌落PCR 驗證陽性克隆，其電泳圖如圖3 所示，陽性克隆大小為1 244 bp，同時提取質粒送上海生工生物工程股份有限公司測序，經過序列比對分析無突變點存在。

圖3 質粒pZ8-TAG4-cg2777 菌落PCR 驗證Fig. 3 Identification of plasmid pZ8-TAG4-cg2777 by colony PCR

2.2.2 質粒pK18mobsacB-cg2777 的構建 基因cg2777

上下同源臂引物序列如表1 所示，引物中小寫字母為引物間的重疊互補序列，用于上下游同源片段的融合，橫線標示部分為引入的酶切位點且前面加有保護堿基。以Corynebacterium glutamicumATCC13032基因組為模板，用引物cg2777-D1 和c2777-D2 擴增基因cg2777的上游片段562 bp，用引物cg2777-D3和cg2777-D4 擴增基因cg2777的下游片段547 bp（見圖4（a））。將上下游片段切膠回收后作為模板，再利用引物對cg2777-D1/D4 擴增上下游融合片段1 088 bp（見圖4（b））。最終的PCR 產物通過XbaⅠ和SbfⅠ雙酶切后與相同酶切的質粒pK18mobsacB進行連接，利用驗證引物對PK18-T1/T2 進行菌落PCR 驗證陽性克隆，其電泳圖如圖5 所示，陽性克隆大小為1 280 bp 同時提取質粒送上海生工生物工程股份有限公司測序，經過序列比對分析無突變點存在。

圖4 cg2777 基因上下游同源臂融合PCRFig. 4 Fusion PCR of cg2777 gene upstream and downstream

圖5 質粒pK18mobsacB-cg2777 菌落PCR 驗證Fig. 5 Identification of plasmid pK18mobsacB-cg2777 by colony PCR

2.3 發(fā)酵驗證

將上述重組質粒分別通過電激轉化到谷氨酸棒桿菌CG14 感受態(tài)細胞得到重組菌株CT14+cg2777和CT14Δcg2777。將重組菌株在以葡萄糖為唯一碳源下進行搖瓶發(fā)酵驗證，并以CT14 菌株作為對照菌株，研究菌株GPAT 功能基因改造對其生長情況、胞內外脂肪酸合成的影響。

2.3.1 GPAT 的功能基因對菌株生長情況的影響 搖瓶發(fā)酵所采用的培養(yǎng)基為CASO 種子培養(yǎng)基和CGXII發(fā)酵培養(yǎng)基，以40 g/L 葡萄糖作為唯一碳源。根據實驗方案，菌株在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h 后，在菌濃（OD600）為5 左右進行轉接使二級發(fā)酵初始OD600為0.3 左右，將搖瓶置于30 ℃、220 r/min 條件下進行培養(yǎng)。改造株的生長狀況如圖6 所示，可見CT14Δcg2777菌株明顯生長緩慢并且發(fā)酵上清液中有乳白色渾濁，可能是菌株細胞膜受損有脂質類物質溢出，這符合我們的預測：基因cg2777除了行使GPAT 功能外還是膜蛋白基因，因此敲除此基因會影響細胞膜生成進而影響菌株生長繁殖，同時阻斷甘油三酯合成途徑導致前體3-磷酸甘油和?；o酶A 不能大量合成油脂，而造成脂質類物質大量外溢。

圖6 不同谷氨酸棒桿菌菌株培養(yǎng)過程的生長曲線和pH 變化Fig. 6 Growth curve and pH change in different Corynebacterium glutamicum strains

同時，對對數生長后期的菌株CT14Δcg2777和對照菌株CT14 進行電鏡掃描分析，其結果如圖7 所示，可見對照菌株CT14 的細胞大小比較均一圓潤，而CT14Δcg2777突變株細胞形態(tài)發(fā)生很大變化，細胞拉長變形出現不規(guī)則形狀，且有很多細胞碎片存在，說明基因cg2777的缺失影響了細胞膜脂質的合成，導致細胞膜不完整且易于破裂。

圖7 CT14 和CT14Δcg2777 的電鏡掃描結果Fig. 7 SEM of CT14 and CT14Δcg2777

2.3.2 GPAT 的功能基因對菌株胞內外脂肪酸的影響

分析發(fā)酵48、60 h 時上述改造株總脂肪酸質量濃度和菌體脂肪酸質量分數，結果如圖8 所示，其中菌體脂肪酸質量分數為胞內脂肪酸質量與菌體干重之比，同時分析發(fā)酵60 h 時上述改造株胞外脂肪酸情況（圖9）。比較圖8 和圖9 可以看出，CT14Δcg2777突變株發(fā)酵48 h 時總脂肪酸質量濃度和菌體脂肪酸質量分數都很低，總脂肪酸質量濃度僅有對照株CT14 的1/4 左右，菌體脂肪酸質量分數是對照菌株質量分數的1/2；發(fā)酵培養(yǎng)延遲到60 h，對照菌株CT14 的脂肪酸變化穩(wěn)定，CT14Δcg2777突變株總脂肪酸質量濃度和菌體脂肪酸質量分數只有少量增加，這符合我們的猜測：cg2777基因是一個膜蛋白基因，影響菌株細胞膜脂質的合成，進而影響菌株生長以及脂肪酸的合成。CT14+cg2777突變株與對照株CT14 相比，其脂肪酸的質量分數并沒有很大變化，且胞外游離脂肪酸的質量濃度僅減少7.1%（圖8（a）），由此推測，基因cg2777行使GPAT 功能，但是油脂合成是一個多酶合作的復雜體系，單一過表達GPAT的編碼基因cg2777并不能明顯地提高油脂的含量。

圖8 不同谷氨酸棒桿菌菌株培養(yǎng)48 h(a)、60 h(b)的總脂肪酸質量濃度和菌體脂肪酸質量分數Fig. 8 Mass concentration of total intracellular fatty acids and mass fraction of fatty acids in different Corynebacterium glutamicum strains cultured for 48 h(a) and 60 h(b)

圖9 不同谷氨酸棒桿菌菌株培養(yǎng)60 h 的胞外脂肪酸質量濃度Fig. 9 Mass concentration of extracellular fatty acids in different Corynebacterium glutamicum strains cultured for 60 h

3 結 論

本研究基于文獻查閱和生物信息學技術預測了Corynebacterium glutamicumATCC13032 編碼GPAT的多個候選功能基因，并選擇其中之一cg2777基因進行后續(xù)驗證。多序列比對結果表明，該基因中間的折疊區(qū)域存在大量的功能保守序列?？缒そY構分析表明，CG2777蛋白存在4 個跨膜結構域，這與AtGPAT9 蛋白存在3～4 個跨膜結構域的特征一致[13]。通過對預測的GPAT 的編碼基因cg2777敲除和過表達，發(fā)現基因cg2777的敲除會嚴重影響菌體增值，細胞形態(tài)發(fā)生很大改變，胞外游離脂肪酸和總脂肪酸含量很低，這與羅泉[14]在集胞藻PCC6803 中關閉GPAT 的編碼基因會破壞類囊體膜結構，生長緩慢的現象一致；而基因cg2777的過表達，僅使胞外游離脂肪酸微量減少，總脂肪酸含量沒有變化。由此推測，基因cg2777行使GPAT 功能，但是油脂合成是一個多酶合作的復雜體系，單一過表達GPAT 的編碼基因cg2777并不能明顯提高油脂含量。本研究為今后利用基因工程手段提高微生物油脂含量提供了方向，同時為進一步揭示谷氨酸棒桿菌油脂合成的分子機制奠定了一定的理論基礎。