吳行貴 肖倩 李沫 張軒 陳茶

作者單位：510120 廣東廣州，廣東省中醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)部，廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)部

糖尿病是以高血糖為特征、以糖代謝紊亂為主要臨床表現(xiàn)的慢性內(nèi)分泌代謝性疾病。糖尿病自身抗體是糖尿病診斷分型的體液免疫標(biāo)志物，尤其能從初診2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）中甄別出緩慢進展的免疫介導(dǎo)成人糖尿病，并預(yù)測其將來對胰島素治療的需要［1］。常用的糖尿病自身抗體包括谷氨酸脫羧酶抗體（glutamate decarboxylase antibody，GADA）、鋅轉(zhuǎn)運體8抗體（Zinc transporter 8 antibody，ZnT8A）、胰島細(xì)胞抗體（islet cell antibody，ICA）、胰島素抗體（insulin antibody，IAA）、酪氨酸磷酸酶抗體（tyrosine phosphatase antibody，IA-2A）等。目前臨床實驗室常用的自身抗體檢測方法包括放射免疫分析法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法和免疫印跡法等。本文旨在探討微陣列酶聯(lián)免疫技術(shù)（Array-enzyme linked immunosorbent assay，Array-ELISA）同時檢測5種糖尿病自身抗體的臨床應(yīng)用價值，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1研究對象及分組 選擇2020年6 —12月在廣東省中醫(yī)院就診的120例糖尿病患者作為研究對象，其中72例1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）患者作為T1DM組，48例T2DM患者作為T2DM組；另外選擇同期23名健康體檢者作為正常對照組。糖尿病患者的診斷分類標(biāo)準(zhǔn)均符合1999年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)的指南要求。健康體檢者排除心、腦、肝、腎等器官慢性疾病及內(nèi)分泌疾病，無糖尿病病史、家族史以及其他自身免疫性疾病病史。

1.2檢測方法 采用糖尿病自身抗體檢測試劑盒（Array-ELISA，深圳市伯勞特生物制品有限公司）測定參考血清標(biāo)本和臨床血清標(biāo)本中GADA、IA-2A、ICA、ZnT8A與IAA 5種糖尿病自身抗體，同時采用糖尿病自身抗體譜檢測試劑盒〔條帶免疫印跡法（immunoblotting test，IBT），斯德潤（北京）醫(yī)療診斷用品有限公司〕進行對比試驗。

1.2.1Array-ELISA 使用樣品稀釋液將血清樣本稀釋26倍，取100 μL加入平衡至室溫的微陣列蛋白芯片反應(yīng)孔中，室溫孵育60 min；棄去孔中液體，每孔加入300 μL洗滌液，靜置60 s，重復(fù)洗滌2次；加入抗人免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）酶結(jié)合物50 μL，室溫孵育30 min；棄去孔中液體，加入300 μL洗滌液，靜置60 s，重復(fù)洗滌2次；加入底物50 μL，室溫孵育30 min；棄去孔中液體，將芯片放入生物芯片閱讀儀，使用DM-5Abs程序進行掃描判讀，計算檢測結(jié)果，陽性指數(shù)（positive index，PI）≥1.0判定為陽性，PI＜1.0判定為陰性。

1.2.2IBT 對比試驗嚴(yán)格按照試劑說明書操作。

1.3臨床應(yīng)用評價 采用IBT作為對比方法，以Array-ELISA作為試驗方法，同步檢測3組血清標(biāo)本，計算5種抗體的陽性符合率、陰性符合率、總符合率、診斷符合率、Kappa值和P值。以總符合率大于95.00%為符合率可接受的標(biāo)準(zhǔn)，以Kappa值＞0.75、配對χ2檢驗P≥0.05為兩種檢驗方法所得結(jié)果一致性較好的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)檢測結(jié)果統(tǒng)計敏感度和特異度，評價Array-ELISA的臨床適用性。

1.4倫理學(xué) 本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)廣東省中醫(yī)院倫理委員會審批（審批號：DF2020-069-01），所有檢測均獲得過受檢者或家屬的知情同意。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 釆用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)。采用Kappa檢驗和配對χ2檢驗分析兩種方法的一致性，報道Kappa值和配對χ2檢驗所得P值。

2 結(jié)果

2.1一般資料 T1DM組、T2DM組和正常對照組的性別、年齡等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），有可比性。見表1。

表1 不同分型兩組糖尿病患者和正常對照組的一般資料

2.2 一致性評價 采用Array-ELISA與IBT法同步檢測5種抗體的總符合率均大于95.00%，Kappa值均大于0.75，配對χ2檢驗所得P值均大于0.05，兩種檢測方法具有高度的一致性。見表2～3。

表2 Array-ELISA與IBT檢測5種自身抗體結(jié)果比較

表3 Array-ELISA與IBT檢測5種自身抗體的結(jié)果一致性評價

2.3臨床診斷效能評價 Array-ELISA檢測3組血清的5種抗體，T1DM組5種抗體的陽性率均明顯高于T2DM組和正常對照組（均P＜0.05），見表4。Array-ELISA聯(lián)合檢測5種抗體對T1DM的診斷敏感度為58.33%，特異度為97.18%，見表5。

表4 Array-ELISA檢測各組5種自身抗體的陽性率比較

表5 采用Array-ELISA單獨或同時檢測5種自身抗體對T1DM的診斷效能

3 討論

糖尿病是一種以高血糖為特征的慢性內(nèi)分泌代謝性疾病。有研究表明，糖尿病自身抗體在疾病發(fā)生前即可被檢測到，而且2種或2種以上抗體陽性的體檢人群中有27%～40%在未來10年內(nèi)會發(fā)展為糖尿病［2］。當(dāng)T1DM患者的父母、子女、兄弟姐妹等一級親屬體內(nèi)檢出糖尿病自身抗體時，其T1DM發(fā)病風(fēng)險明顯增大［3］。有研究顯示，糖尿病患者一級親屬體內(nèi)存在2種抗體陽性者，3年內(nèi)糖尿病發(fā)病率為39%，5年內(nèi)為68%；體內(nèi)存在3種抗體陽性者5年內(nèi)發(fā)病率可高達100%［4］。國內(nèi)一項多中心研究報告顯示，緩慢進展的免疫介導(dǎo)成人糖尿病在我國的發(fā)病率為5.9%［5］。美國糖尿病協(xié)會指出這類患者占初診T2DM的10%～15%，其胰島β細(xì)胞功能衰減速度較快，可達T2DM患者的3倍［6］。因此，胰島自身抗體檢測對于糖尿病的早期診斷和分型有重要價值，可通過早期醫(yī)學(xué)干預(yù)來降低糖尿病酮癥酸中毒等并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險。

目前臨床上用于糖尿病診斷分型的自身抗體主要包括GADA、IA-2A、ICA、ZnT8A、IAA 5種。谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）由同工酶GAD65和GAD67組成，其中抗GAD65抗體與糖尿病進展密切相關(guān)［7-8］。GADA早期出現(xiàn)會抑制GAD的作用，使抑制性神經(jīng)遞質(zhì)生成受到阻礙，導(dǎo)致胰島細(xì)胞功能受損［9］。由于GADA在患者體內(nèi)存在的時間長，因此與其他抗體相比，其陽性檢出率較高，與胰島細(xì)胞損傷有較強的相關(guān)性［10］。糖尿病患者血清中檢出IA-2A，提示患者體內(nèi)存在胰島β細(xì)胞的特異性自身免疫應(yīng)答。IA-2A的診斷特異度高，但隨著病程的進展，陽性率逐漸降低，提示IA-2A主要存在于疾病的早期階段。ICA是一種能與胰島細(xì)胞多種分子發(fā)生反應(yīng)的多克隆自身抗體的統(tǒng)稱，通過激活補體系統(tǒng)對胰島細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)，促使細(xì)胞溶解、凋亡進而導(dǎo)致糖尿?。?1］。ICA常見于青少年患者，隨著病程的延長，其陽性率逐漸降低。標(biāo)準(zhǔn)化的糖尿病自身抗體可用于成人糖尿病的分類以及出生時具有遺傳危險因素的兒童T1DM的前瞻性研究［12］。胰島β細(xì)胞特異性鋅轉(zhuǎn)運體是含有6個跨膜結(jié)構(gòu)域的多通道蛋白，可參與調(diào)控胰高血糖素和胰島素的旁分泌。ZnT8A在T1DM新發(fā)病例和高風(fēng)險人群（糖尿病患者一級親屬）中陽性率較高［13］。研究表明， ZnT8A陽性的青少年糖尿病患者血液pH值低于陰性患者，酮癥酸中毒的風(fēng)險更高［14］。IAA是與糖尿病診斷相關(guān)的混合抗體，可與胰島細(xì)胞內(nèi)多種抗原結(jié)合。IAA并非糖尿病的特異性抗體，在其他內(nèi)分泌相關(guān)疾?。ㄈ缫葝u素綜合征和甲狀腺疾病等）患者體內(nèi)亦可檢出。由于外來胰島素對體內(nèi)IAA水平存在干擾，因此建議在患者尚未使用胰島素治療時進行IAA檢測。

臨床上針對糖尿病自身抗體有多種檢測方法，其中采用硫35放射性同位素標(biāo)記的放射結(jié)合沉淀法的重復(fù)性好、線性范圍寬，敏感度和特異度高，被視為胰島自身抗體檢測的參考方法［15］。然而由于該方法對實驗條件要求高、操作步驟復(fù)雜、影響因素多，因此不適于在一般臨床實驗室開展?；瘜W(xué)發(fā)光法用于檢測自身抗體具有高敏感度、高特異度和自動化等優(yōu)點，但1次只能檢測1個抗體。IBT能同時檢測多種糖尿病自身抗體，但重復(fù)性和均一性較差。Array-ELISA可進行高通量檢測，能同時檢測5種自身抗體，檢測結(jié)果通過生物芯片閱讀儀自動判讀，可減少人為判讀誤差。本研究顯示，Array-ELISA和IBT兩種方法對5種自身抗體的診斷符合率均在95.00%以上，Kappa值均大于0.75，具有高度一致性，說明Array-ELISA適用于臨床上檢測糖尿病自身抗體。Array-ELISA對5種抗體同時檢測T1DM的特異度高達97.18%，但敏感度僅為58.33%，低于胡紀(jì)文等［16］研究結(jié)果，可能與研究對象的遺傳背景、年齡、病程等不同有關(guān)。

綜上所述，糖尿病作為一種慢性代謝性疾病易引發(fā)多種并發(fā)癥，如糖尿病腎病、冠心病等［17-18］。自身抗體對糖尿病的早期診斷分型具有重要意義。5種自身抗體聯(lián)合檢測有助于提高陽性檢出率，降低臨床漏診、誤診概率。Array-ELISA操作簡便，檢測效率高，能有效輔助臨床進行糖尿病診斷分型，具有一定的應(yīng)用價值，適用于臨床實驗室開展。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突