王蓓 代聰偉 李娜 楊艷艷 秦英

(河北省人民醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050051)

NDRG1基因，也稱(chēng)為Drg-1,Cap43,RTP,Rit42 and PROXY-1，屬于NDRG基因家族。這個(gè)家族由四個(gè)基因組成：NDRG1，NDRG2，NDRG3，NDRG4。其余三個(gè)基因與NDRG1是同源性基因，有57%～65%相似性〔1〕。NDRG1，是43 kD蛋白，由394個(gè)氨基酸組成，廣泛存在于多細(xì)胞生物的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中〔2〕。NDRG1表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移關(guān)系的相關(guān)研究表明：NDRG1在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用〔3,4〕。但有關(guān)該方面的研究報(bào)道目前仍不多，而且也存在較大爭(zhēng)議。NDRG1表達(dá)與腫瘤尤其在卵巢腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性如何，目前國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于NDRG1與卵巢癌細(xì)胞OVCAR3的研究報(bào)道。本研究采用分子生物學(xué)方法，改變卵巢癌細(xì)胞OVCAR3中NDRG1的表達(dá)，分析其對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞株中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院提供。

1.2試劑及儀器 細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640、胎牛血清購(gòu)自Sigma公司，Trizol試劑及LipofectamineTM 2000、RNA提取試劑購(gòu)自Invitrogen 公司，Transwell小室購(gòu)自Costar公司，RT-PCR試劑盒及引物購(gòu)自Takara公司。質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/NDRG1和pcDNA3.1(+)為Clontech合成。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) OVCAR3細(xì)胞培養(yǎng)于37℃含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的RPMI1640，0.25%胰蛋白酶消化傳代，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d,胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù),4×105/孔細(xì)胞接種于6孔板,當(dāng)細(xì)胞融合度為80%時(shí)即可轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí),按照Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,實(shí)驗(yàn)分3組：未轉(zhuǎn)染組(control組)，陰性對(duì)照組〔pcDNA3.1(+)組〕，實(shí)驗(yàn)組〔pcDNA3.1(+)/NDRG1組〕。

1.4.2熒光定量PCR檢測(cè)NDRG1在OVCAR3細(xì)胞中的表達(dá) 按 Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取轉(zhuǎn)染后48 h未轉(zhuǎn)染組(control組)，陰性對(duì)照組〔pcDNA3.1(+)組〕，實(shí)驗(yàn)組〔pcDNA3.1(+)/NDRG1組〕細(xì)胞的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)按照Takara 反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 的第一條鏈,利用Primer5.0設(shè)計(jì)NDRG1的鑒定引物:上游引物5′-ACACCTACCGCCAGCACA-3′,下游引物：5′-GCCACAGTCCGCCATCTT-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度245 bp。PCR擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性10 min，95℃ 15 s，退火58℃ 20 s，延伸72℃ 27 s，40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參照。上游引物:5′-ACTTAGTTGCGTTACACCCTT-3′,下游引物:5′-GTCACCTTCACCGTTCCA-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為156 bp。以上兩對(duì)PCR引物均由Takara公司合成。PCR結(jié)束后得出Ct值，分析各組之間NDRG1基因的mRNA表達(dá)水平差異。

1.4.3Western印跡檢測(cè) 將收集的細(xì)胞用含非離子去垢劑的緩沖液充分裂解，進(jìn)行蛋白定量，取50 μg處理好的蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析；100 V恒壓轉(zhuǎn)膜2 h；5 %脫脂奶粉室溫封閉1 h；將膜與抗 NDRG1抗體室溫孵育1 h，4℃過(guò)夜；TBST緩沖液洗膜3次，每次15 min，加入二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗膜3次；化學(xué)法發(fā)光,膠片顯色，用Fluorochem E分析結(jié)果。以β-actin作為內(nèi)參照。

1.4.4RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞p21及p53基因的mRNA表達(dá) 取各組細(xì)胞，同上述抽提總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR。PCR引物如下：p21上游引物為:5′-TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA-3′;下游引物為:5′-CGCTATCTGAGCAGCGCTCAT-3′;產(chǎn)物243 bp。p53上游5′GCGCACAGAGGAAGAGAATC-3′，下游5′-GGCCAACTTGTTCAGTGGAG-3′，產(chǎn)物501 bp。內(nèi)參為β-actin同1.4.2。每一樣本的最后結(jié)果為3次獨(dú)立電泳實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.4.5Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞p21及p53及基因的蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞，具體過(guò)程同上述。一抗為鼠抗人p21單克隆抗體(1∶200)及鼠抗人p53單克隆抗體(1∶200)，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1∶5 000)。每一樣本的最后結(jié)果為3次獨(dú)立電泳實(shí)驗(yàn)的平均值。以β-actin作為內(nèi)參照。

1.4.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化成單細(xì)胞懸液；具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，加入碘化丙啶(PI，濃度為 100 mg/L)溶液染色20～30 min 后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.4.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化成單細(xì)胞懸液；具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，每組細(xì)胞重復(fù)檢測(cè)4次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析法、LSD-t法。

2 結(jié) 果

2.1PCR檢測(cè)NDRG1 mRNA表達(dá) pcDNA3.1(+)/NDRG1組中NDRG1 mRNA相對(duì)表達(dá)量(1.00±0.03)明顯高于control組(0.57±0.04)和pcDNA3.1(+)組(0.59±0.02，P<0.05)。

2.2Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染NDRG1過(guò)表達(dá)載體后細(xì)胞中蛋白表達(dá)的變化 在使用NDRG1過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/NDRG1和空載體pcDNA3.1(+)分別轉(zhuǎn)染OVCAR3細(xì)胞，并使用RT PCR和Western印跡方法鑒定轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果表明：control組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體的OVCAR3細(xì)胞中NDRG1表達(dá)量與轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/NDRG1組相比顯著降低(0.46±0.02、0.49±0.03、1.85±0.05，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.3NDRG1作用后卵巢癌細(xì)胞OVCAR3中p21及p53基因的mRNA表達(dá) control組、pcDNA3.1(+)組 NDRG1、p21及p53 mRNA表達(dá)均明顯低于pcDNA3.1(+)/NDRG1組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

1～3：control組，pcDNA3.1(+)組，pcDNA3.1(+)/NDRG1組，下圖同圖1 各組OVCAR3細(xì)胞NDRG1表達(dá)水平比較

表1 各組卵巢癌細(xì)胞OVCAR3中p21及 p53基因的mRNA表達(dá)

2.4NDRG1作用后卵巢癌細(xì)胞OVCAR3中p21及p53基因的蛋白表達(dá) control組及pcDNA3.1(+)組NDRG1、p21及p53的表達(dá)均明顯低于pcDNA3.1(+)/NDRG1組(P<0.05)，見(jiàn)表2，圖2。

表2 各組OVCAR3細(xì)胞NDRG1蛋白表達(dá)水平比較

圖2 各組OVCAR3細(xì)胞NDRG1、p21及 p53基因表達(dá)水平比較

2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 pcDNA3.1(+)/NDRG1組細(xì)胞與control組、pcDNA3.1(+)組相比，G0/G1期細(xì)胞數(shù)明顯增多,而S期細(xì)胞數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，G2/M期細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯變化(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組OVCAR3細(xì)胞 周期

2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞OVCAR3細(xì)胞凋亡的影響 與control組、pcDNA3.1(+)組比較，pcDNA3.1(+)/NDRG1組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，而control組pcDNA3.1(+)組之間細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組OVCAR3 細(xì)胞凋亡

3 討 論

本研究說(shuō)明人卵巢細(xì)胞癌OVCAR3細(xì)胞受到質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/NDRG1轉(zhuǎn)染的影響，出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯。細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)表明，發(fā)現(xiàn)上調(diào)NDRG1基因后OVCAR3細(xì)胞凋亡率顯著提高；本研究結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)NDRG1可以顯著增加OVCAR3細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期發(fā)生改變，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，證明了NDRG1在卵巢癌細(xì)胞中可能作為抑癌基因發(fā)揮著腫瘤抑制作用。

很多文獻(xiàn)表明，NDRG1作為一種腫瘤抑制基因，在轉(zhuǎn)移瘤中NDRG1基因的低表達(dá)，由N-myc下調(diào)實(shí)現(xiàn)，并且也可由過(guò)表達(dá)HIF-1、p53等多種轉(zhuǎn)錄因子實(shí)現(xiàn)〔5〕。細(xì)胞中DNA損傷后，NDRG1表達(dá)是通過(guò)p53介導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的，此過(guò)程對(duì)p53介導(dǎo)的凋亡是非常必要的條件之一〔6〕。在胰腺癌的相關(guān)研究中證實(shí)，NDRG1基因表達(dá)較低的細(xì)胞株比表達(dá)高的細(xì)胞株侵襲遷移能力明顯增強(qiáng)〔7〕。人肝細(xì)胞肝癌中NDRG1的過(guò)表達(dá)與腫瘤的侵襲性和預(yù)后差關(guān)系密切，提示NDRG1在肝癌中具有加速腫瘤生長(zhǎng)的作用；低表達(dá)肝癌細(xì)胞株中NDRG1可使細(xì)胞的增殖和侵襲作用顯著受到抑制，并可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明NDRG1基因具有抗凋亡作用〔8〕。然而，很多研究證明，腫瘤組織中NDRG1的表達(dá)與正常細(xì)胞差異不大或稍有下降〔9〕。NDRG1基因的下調(diào)與結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌等患者愈后不良關(guān)系密切〔10～16〕。

p21基因是一種抑癌基因，作為細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶抑制劑(CKIs)家族中的一員，是目前已知的具有最廣泛激酶抑制活性的CKIs，不僅在子宮內(nèi)膜癌、肺癌、胃癌等惡性腫瘤組織中不表達(dá)或表達(dá)減少，而且與腫瘤分化程度、侵襲轉(zhuǎn)移能力關(guān)系密切〔17〕。MDM2主要與p53蛋白相結(jié)合，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及凋亡的多種信號(hào)通路。很多惡性腫瘤組織中MDM2表達(dá)異常，MDM2的過(guò)度表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后較差關(guān)系密切，MDM2今后也可能成為腫瘤治療的另一個(gè)新靶點(diǎn)〔18〕。Kovacevic等〔19〕學(xué)者認(rèn)為，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將NDRG1基因?qū)肴饲傲邢侔㏄C3MM細(xì)胞株中，結(jié)果證實(shí)細(xì)胞凋亡加速而增殖明顯下降，分子機(jī)制可能與NDRG1通過(guò)非p53依賴(lài)信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)p21的表達(dá)密切相關(guān)。在非轉(zhuǎn)移瘤中p53的改變可調(diào)節(jié)NDRGl的表達(dá)，而在轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞中通過(guò)細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放來(lái)調(diào)節(jié)其表達(dá)，這個(gè)過(guò)程不依賴(lài)p53的表達(dá)〔20〕。另外，NDRG1的低表達(dá)可消除p53基因介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，表明 NDRG1基因與細(xì)胞的多種傳導(dǎo)通路關(guān)系密切。

NDRG1基因不僅存在于多種正常細(xì)胞和組織中，在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著較為重要的作用，并且在腫瘤細(xì)胞和組織的發(fā)生發(fā)展中也起著至關(guān)重要的作用〔21〕。人類(lèi)很多腫瘤組織中，如肺癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌等，NDRG1 基因都呈現(xiàn)低表達(dá)〔22～25〕；但是，NDRG1轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞中，可使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著抑制。也有研究證實(shí)，通過(guò)流式細(xì)胞儀研究正常細(xì)胞中NDRG1的表達(dá)出現(xiàn)周期性變化，在G1期和G2/M期達(dá)到較高水平，而在S期則呈現(xiàn)較低表達(dá)〔26〕；然而，在腫瘤細(xì)胞中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)NDRG1表達(dá)呈現(xiàn)周期性表達(dá)，在細(xì)胞周期表達(dá)中出現(xiàn)均一性，這表明NDRG1被轉(zhuǎn)染到人腫瘤細(xì)胞株中可使細(xì)胞周期受到阻滯，同時(shí)可以誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的改變。