崔艷紅 張軒斌 趙江 金博 李克芳 張偉杰

(1南陽市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科二病區(qū)，河南 南陽 473000;2鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤一科)

肺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，對患者及社會造成嚴重的威脅〔1〕。微小RNA(miRNA)是一類廣泛存在的內(nèi)源性非編碼RNA，參與細胞的增殖、分化、凋亡等重要病理生理過程〔2〕。越來越多的研究證明，miRNA與腫瘤細胞的增殖、凋亡有密切聯(lián)系，全基因組表達譜系顯示，miR-21在結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、胃癌等腫瘤組織中高表達，且可增強淋巴瘤細胞遷移能力〔3～5〕。研究顯示，下調(diào)miR-21的表達，可抑制肺癌H460細胞的生長，增加細胞的凋亡〔6〕。與正常乳腺組織相比，叉頭蛋白P2抗體(FOXP2)在乳腺癌組織中的表達顯著降低，可抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲〔7〕。但FOXP2在肺癌細胞中的表達及其對肺癌細胞增殖和凋亡的影響未見報道，且miR-21-5p是否靶向調(diào)控FOXP2的表達影響肺癌細胞的增殖和凋亡目前還尚未可知。故本研究通過分子生物學技術(shù)探究miR-21-5p、FOXP2在肺癌細胞中的表達及其靶向關(guān)系，為臨床分子靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 肺癌細胞株A549、NCl-H460、H1299、正常肺上皮細胞BEAS-2B均購自中國科學院上海細胞庫；Trizol試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；熒光定量試劑盒購自大連TaKaRa公司；FOXP2、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、p27、GAPDH一抗均購自美國Abcam公司；B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3一抗均購自美國CST公司；熒光素酶活性試劑盒購自Promega公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞的培養(yǎng)及模型的建立 肺癌細胞株A549、NCl-H460、H1299及正常肺上皮細胞BEAS-2B在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5%CO2、37℃條件培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.2實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測miR-21-5p、FOXP2的表達 肺癌細胞株以5×104個/ml接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)24 h，收集細胞，Trizol提取總RNA，檢測RNA的濃度和純度；反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行qRT-PCR，qRT-PCR程序為95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個循環(huán)；反應體系為20 μl：2×SYBR Mix10 μl，上下游引物各0.5 μl，10×cDNA模板1 μl，H2O 8 μl。引物序列：miR-21-5p：正義鏈5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，反義鏈5′-GCCGCTAGCTTATCAGACTGATGT-3′；U6：正義鏈5′-CTCGTTCACGAATTTGCCT-3′，反義鏈5′-TCACGAATTTGCGT-3′；FOXP2：正義鏈5′-GGTCATGACCCCTGATTAGG-3′，反義鏈5′-AGTCCTCTAGAGGCTTCAT-3′；β-actin：正義鏈5′-CAG CGA CAC CCA CTC CTC-3′，反義鏈5′-TGA GGT CCA CCA CCC TGT-3′。分別以U6、β-actin為miR-21-5p、FOXP2的內(nèi)參基因計算相對表達量。

1.2.3Western印跡檢測蛋白表達情況 肺癌細胞株以5×104個/ml接種于6孔板中貼壁培養(yǎng)24 h，收集細胞，RIPA裂解液冰上裂解5 min提取總蛋白，測定總蛋白濃度，蛋白與樣品緩沖液混合后煮沸5 min變性蛋白；10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)跑膠，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶封閉1.5 h；一抗4℃孵育過夜，TBST清洗3次/5 min；稀釋二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3次/5 min；ECL顯影液顯影，GIS凝膠成像儀采集圖片，以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白表達水平。

1.2.4雙熒光素酶實驗檢測miR-21-5p 對FOXP2的影響 擴增FOXP2基因的轉(zhuǎn)錄本3′UTR，構(gòu)建野生型FOXP2-3′UTR(WT-pGL3-FOXP2 3′UTR)質(zhì)粒；采用定點突變技術(shù)，將3′UTR上的與miRNA結(jié)合的核心區(qū)域突變構(gòu)建突變型FOXP2-3′UTR(MUT-pGL3-FOXP2-3′UTR)質(zhì)粒；將兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至肺癌細胞，轉(zhuǎn)染48 h后檢測熒光強度。

1.2.5細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h將細胞接種于24孔板中，使細胞貼壁密度約80%。設計并合成miR-21-5p mimic、anti-miR-21-5p及其對應陰性序列，使用lip2000將合成序列分別轉(zhuǎn)染肺癌細胞，空白對照(NC)組不做任何處理，無血清DMEM培養(yǎng)6 h，換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后進行功能試驗，并繼續(xù)培養(yǎng)篩選穩(wěn)定低表達miR-21-5p的細胞株。

設計并退火獲得si-con、si-FOXP2、pcDNA-con、pcDNA-FOXP2的shRNA序列，由吉凱公司進行慢病毒包裝，并進行滴度測定；添加相應的慢病毒于完全培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染生長狀態(tài)良好的細胞，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h換液，篩選穩(wěn)定過表達或干擾FOXP2的細胞，NC組不做任何處理；另外在穩(wěn)定低表達的miR-21-5p的基礎上沉默F(xiàn)OXP2基因，獲得穩(wěn)定低表達FOXP2 的anti-miR-21-5p+si-FOXP2細胞株。

1.2.6四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測細胞增殖情況 2.5%胰蛋白酶消化肺癌細胞，調(diào)整細胞濃度為2×104個/ml，接種于6孔板中，分別轉(zhuǎn)染miR-21-5p mimic、anti-miR-21-5p、pcDNA-FOXP2及其陰性序列或共轉(zhuǎn)染anti-miR-21-5p、si-FOXP2；轉(zhuǎn)染48 h后棄去舊培養(yǎng)基，加入MTT 20 μl 混勻，培養(yǎng)4 h；然后每孔加DMSO溶液100 μl 混勻，培養(yǎng)15 min；采用酶標儀檢測吸光值，每組3個復孔。

1.2.7流式細胞儀檢測細胞凋亡 轉(zhuǎn)染后A549細胞培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次；加入500 μl 1×結(jié)合緩沖液，5 μl Annexin V-FITC，避光孵育15 min；加入2.5 μl PI，孵育5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-21-5p和FOXP2在肺癌細胞和正常肺上皮細胞中的表達 與正常肺上皮細胞BEAS-2B比較，肺癌細胞株A549、NCl-H460、H1299中miR-21-5p表達水平均顯著升高，F(xiàn)OXP2 mRNA及蛋白水平均顯著降低(均P<0.05)，見圖1、表1。選擇A549細胞進行后續(xù)實驗。

圖1 FOXP2蛋白表達

表1 miR-21-5p和FOXP2在肺癌細胞和正常肺上皮 細胞中的表達

2.2miR-21-5p靶向調(diào)控FOXP2的表達 生物信息學軟件預測顯示，miR-21-5p與FOXP2 3′UTR存在堿基互補序列見圖2，雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-21-5p組WT-FOXP2表達水平顯著低于miR-NC組(P<0.001)，見表2。提示miR-21-5p與FOXP2 3′UTR區(qū)域特異性結(jié)合。Western印跡進一步證實miR-21-5p對FOXP2的影響，miR-21-5p組FOXP2蛋白表達水平(0.29±0.03)顯著低于miR-NC組(0.62±0.06)，anti-miR-21-5p組FOXP2蛋白表達水平(0.94±0.08)顯著高于anti-miR-NC組(0.61±0.05,均P<0.05)，見圖3。進一步證實了 miR-21-5p可與FOXP2結(jié)合負向調(diào)控FOXP2水平。

圖3 miR-21-5p靶向調(diào)控FOXP2的表達

表2 雙熒光素酶報告實驗

圖2 FOXP2的3′UTR中含有與miR-21-5p互補的 核苷酸序列

2.3抑制miR-21-5p表達對肺癌A549細胞增殖的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-21-5p組miR-21-5p水平顯著降低，48 h、72 h OD值顯著降低，CyclinD1蛋白水平顯著降低，p21、p27蛋白水平顯著升高(均P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 增殖相關(guān)蛋白表達

表3 抑制miR-21-5p表達對肺癌A549細胞增殖的影響

2.4抑制miR-21-5p表達對肺癌A549細胞凋亡的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-21-5p組細胞凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低，Bax、酶切caspase3蛋白水平顯著升高(均P<0.05)。見圖5、表4、圖6。

圖5 凋亡相關(guān)蛋白表達

表4 抑制miR-21-5p表達對肺癌A549細胞凋亡的影響

圖6 抑制miR-21-5p表達對肺癌A549細胞凋亡的影響

2.5FOXP2過表達對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響 與pcDNA組比較，pcDNA-FOXP2組FOXP2水平顯著升高，48 h、72 h OD值顯著降低，CyclinD1蛋白水平顯著降低，p21蛋白水平顯著升高(均P<0.05)；流式細胞儀檢測細胞結(jié)果顯示，與pcDNA組比較，pcDNA-FOXP2組細胞凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低，Bax蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖7、表5。

圖7 FOXP2和增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達

表5 FOXP2過表達對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

2.6干擾FOXP2表達逆轉(zhuǎn)了抑制miR-21-5p表達對肺癌A549細胞增殖和凋亡的作用 與anti-miR-21-5p+si-NC組比較，anti-miR-21-5p+si-FOXP2組FOXP2水平顯著降低，48 h、72 h OD值顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，CyclinD1、Bcl-2蛋白水平顯著升高，p21、Bax蛋白水平顯著降低(均P<0.05)。見圖8、表6。

1～2：anti-miR-21-5p+si-NC組、anti-miR-21-5p+si-FOXP2組圖8 FOXP2和增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達

表6 干擾FOXP2表達逆轉(zhuǎn)了抑制miR-21-5p表達對肺癌A549細胞增殖和凋亡的作用

3 討 論

miRNA廣泛存在與真核生物中，其通過與靶基因mRNA 的 3′UTR區(qū)域結(jié)合，抑制mRNA的翻譯，調(diào)控基因的表達〔8〕。miR-21已被證明與多種癌癥的發(fā)生相關(guān)，非小細胞肺癌組織中miR-21表達顯著高于配對癌旁組織，與非小細胞肺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔9〕。MiR-21在肺癌細胞HBE、H460、A549和H446中高表達，抑制MiR-21的表達，細胞增殖率下降〔10〕。本研究結(jié)果提示miR-21-5p是肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵因子。

研究顯示，miR-21參與多種癌癥的進展，如胃癌、結(jié)腸癌、腎細胞癌、食管癌等，其在多種癌癥中表達上調(diào)〔11～13〕。miR-21在膽管癌細胞中表達升高，miR-21通過抑制PECK的表達促進膽管癌細胞的侵襲能力〔14〕。miR-21在肺癌NCI-H446細胞中高表達，抑制miR-21的表達可增加細胞凋亡率〔15〕。本研究結(jié)果提示miR-21-5p在肺癌A549細胞中可能促進細胞的增殖、抑制細胞凋亡，促進肺癌的發(fā)展。另外還發(fā)現(xiàn)，抑制miR-21-5p表達后，F(xiàn)OXP2水平顯著升高，提示miR-21-5p可能與FOXP2表達相關(guān)。本研究提示miR-21-5p可能調(diào)控FOXP2的表達，miR-21-5p可通過與FOXP2 3′UTR區(qū)域直接結(jié)合負性調(diào)控FOXP2的表達。

miR-494-3p在腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用〔16〕。FOXP2在胃癌細胞中顯著低表達〔17〕。FOXP2在胰腺癌組織中下調(diào)表達，miR-23a通過調(diào)控FOXP2的表達促進胰腺癌細胞的增殖和侵襲〔18〕。乳腺癌中敲除FOXP2基因促進乳腺癌細胞的增殖、腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，F(xiàn)OXP2表達水平的降低是惡性臨床乳腺癌的顯著特征，與患者生存率低顯著相關(guān)〔19〕。FOXP2 通過調(diào)控AKT信號通路抑制肝細胞癌增殖〔20〕。本研究提示過表達FOXP2可抑制細胞的增殖，促進細胞的凋亡；抑制FOXP2的表達可部分逆轉(zhuǎn)低表達miR-21-5p對肺癌細胞的增殖抑制、凋亡促進作用，F(xiàn)OXP2在肺癌細胞中低表達，發(fā)揮抑制細胞增殖和凋亡的作用。