張瑛瑜 徐宏仙 楊林峰 陳芳

(1三亞市中醫(yī)院婦產(chǎn)科，海南 三亞 572000；2中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院婦產(chǎn)科)

卵巢腫瘤是全世界女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，該病常在晚期被診斷，并有腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移〔1〕，死亡率高達(dá)60%～65%〔2〕。當(dāng)病變局限于卵巢時(shí)，5年生存率高于90%，但當(dāng)病變?cè)诟骨粌?nèi)播散時(shí)，生存率低于20%〔3〕。因此，明確該病發(fā)病機(jī)制，將為該病的診斷與治療提供極大幫助。內(nèi)分泌干擾物(EDCs)是環(huán)境中天然或人工合成的制劑，可干擾體內(nèi)激素正常功能，從而對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾作用〔4〕。而人體內(nèi)正常激素的循環(huán)水平可能與幾種生殖系統(tǒng)癌癥的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。如雌激素水平異常與卵巢、乳腺及宮頸腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)〔5～7〕，這些腫瘤是高雌激素受體陽(yáng)性或雌激素反應(yīng)性腫瘤。因此，具有雌激素或雌激素活性的EDCs可能是發(fā)生雌激素反應(yīng)性癌癥的重要危險(xiǎn)因素。三氯生(TCS)是一種合成的氯化苯醚雙酚，用作廣譜抗菌劑〔8〕。TCS是肥皂、除臭劑、牙膏等衛(wèi)生產(chǎn)品的常見(jiàn)成分，使用濃度高達(dá)0.3%〔9〕。盡管TCS尚未被歸類為EDCs，但已被認(rèn)為是一種潛在EDC〔10〕。既往有研究發(fā)現(xiàn)，TCS可通過(guò)雌激素受體依賴途徑調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而刺激細(xì)胞生長(zhǎng)〔11〕，然而TCS對(duì)卵巢癌細(xì)胞其他惡性生物學(xué)功能的影響尚未被闡明。本研究旨在分析TCS對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲功能的作用及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1一般資料 細(xì)胞培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780購(gòu)自美國(guó)ATCC，使用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活性以1×104個(gè)/孔的密度將A2780細(xì)胞接種于96孔板中，以不同濃度TCS(Sigma Aldrich，美國(guó))(0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)暴露細(xì)胞24 h，隨后向每孔加入10 μl CCK-8試劑(Dojindo，日本)，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h后置于分光光度計(jì)中測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)。細(xì)胞相對(duì)活性=(處理組OD450-背景組OD450)/(對(duì)照組OD450-背景組OD450)。每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。

1.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)細(xì)胞遷移能力以5×105/孔的密度將A2780細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至90%時(shí)，用20 μl移液管尖刮除細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM沖洗細(xì)胞2次。分別將細(xì)胞暴露于含0、10-8、10-6mol/L TCS的無(wú)血清DMEM中再培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后對(duì)劃痕區(qū)域進(jìn)行顯微鏡觀察和成像，使用Image J計(jì)算劃痕面積(Area)。細(xì)胞相對(duì)遷移活性(%)=(處理組Area 24 h-處理組Area 0 h)/(對(duì)照組Area 24 h-對(duì)照組Area 0 h)×100%。

1.4細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell) 測(cè)定細(xì)胞侵襲能力在Transwell(Corning，美國(guó))小室上層涂抹40 μl的基質(zhì)膠(Corning，美國(guó))，制備2×105/孔的密度、不含血清的A2780細(xì)胞懸液，分別給予0、10-8、10-6mol/L TCS刺激，取200 μl滴加于Transwell上室中，下室加入600 μl含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛固定Transwell下層細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色，后在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)。

1.5ERK信號(hào)通路驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 在對(duì)A2780細(xì)胞進(jìn)行TCS暴露前，用50 μmol/L的ERK抑制劑PD98059預(yù)處理細(xì)胞24 h。

1.6Western印跡測(cè)定蛋白表達(dá)水平用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(碧云天，中國(guó))中冰裂30 min，然后4℃ 15 000 r/min離心收集上清液，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天，中國(guó))進(jìn)行蛋白定量，隨后取40 μg總蛋白100℃加熱10 min變性，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，后轉(zhuǎn)移到聚偏氟甲酸(PVDF)膜(Millipore，美國(guó))上。用封閉液(碧云天，中國(guó))室溫封閉PVDF膜2 h。然后在4℃將膜與以下主要抗體孵育過(guò)夜：p-ERK、ERK、p-NF-κB p65、NF-κB p65、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9及GAPDH(以上抗體均購(gòu)自Cell signaling technology，美國(guó))。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。孵育后用TBST清洗膜3次，后在室溫下用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合的二抗孵育PVDF膜1 h。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(碧云天，中國(guó))對(duì)蛋白熒光信號(hào)進(jìn)行顯像。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Graphpad Prism軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1TCS對(duì)卵巢癌細(xì)胞活性的影響 不同濃度TCS(0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)暴露24 h對(duì)A2780細(xì)胞活性(1.00±0.04、1.07±0.05、1.02±0.04、1.04±0.08、1.03±0.10、1.01±0.06)無(wú)明顯影響(P>0.05)。從中選擇了10-8和10-6mol/L TCS暴露濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2TCS對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與(TCS 0 mol/L)相比，TCS暴露顯著促進(jìn)A2780細(xì)胞發(fā)生遷移(均P<0.05)，且TCS 10-8mol/L的促進(jìn)作用較10-6mol/L更為明顯(P<0.05)。侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與劃痕實(shí)驗(yàn)一致(均P<0.05)。見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 TCS對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移的影響(×40)

圖2 TCS對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

2.3TCS誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞表達(dá)MMP-2/-9增加 TCS處理可顯著提高M(jìn)MP-2和MMP-9的蛋白水平(均P<0.05)，且10-8mol/L處理組的促進(jìn)效果更為明顯(均P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 TCS誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞表達(dá)MMP-2及 MMP-9增加

2.4TCS通過(guò)誘導(dǎo)ERK磷酸化而促進(jìn)NF-κB活化 TCS處理可顯著促進(jìn)ERK和NF-κB蛋白發(fā)生磷酸化(均P<0.05)。為進(jìn)一步驗(yàn)證TCS對(duì)ERK/NF-κB信號(hào)通路的激活作用，使用ERK/NF-κB抑制劑PD98059預(yù)處理A2780細(xì)胞，而后暴露于TCS，前者特異性地阻斷ERK/NF-κB磷酸化。見(jiàn)圖4。

圖4 TCS通過(guò)誘導(dǎo)ERK磷酸化而促進(jìn)NF-κB活化

3 討 論

近幾十年來(lái)，EDCs及其對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響越來(lái)越受到重視〔12〕。盡管已有研究表明TCS可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞〔13〕和肺癌細(xì)胞〔14〕的遷移和侵襲。在卵巢癌中，僅有報(bào)道證實(shí)TCS可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，但尚無(wú)關(guān)于TCS暴露與卵巢癌細(xì)胞遷移和信息能力的研究。本研究發(fā)現(xiàn)TCS幾乎不影響卵巢癌細(xì)胞活性，但顯著增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞A2780的遷移和侵襲，這與之前在其他癌細(xì)胞系的研究一致。因此，本研究結(jié)果提示TCS可能也是一種促進(jìn)卵巢癌進(jìn)展的致癌物質(zhì)。

關(guān)于TCS誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的潛在機(jī)制研究，首先發(fā)現(xiàn)了TCS可促進(jìn)MMP-2/-9的表達(dá)增加。MMP-2/-9是MMPs家族的重要成員，鑒于其具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用，MMP-2/-9的高表達(dá)被證明與卵巢癌的高轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)〔15〕。MMP-2/-9在TCS暴露后的表達(dá)在其他癌細(xì)胞中也有上調(diào)，例如乳腺癌細(xì)胞〔13〕。本研究發(fā)現(xiàn)TCS誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞MMP-2/-9表達(dá)增加可能有助于癌細(xì)胞遷移和侵襲。

已有研究證實(shí)在多種癌細(xì)胞中ERK/NF-κB信號(hào)通路的激活對(duì)于調(diào)節(jié)MMP-2/-9的活性非常重要〔16〕。本研究結(jié)果表明MMP-2/-9的激活趨勢(shì)與ERK/NF-κB途徑的激活趨勢(shì)一致。既往有研究發(fā)現(xiàn)TCS可通過(guò)ERK/NF-κB信號(hào)途徑發(fā)揮作用。如Cheng等〔17〕發(fā)現(xiàn)TCS可特異性活化ERK干擾小鼠胚胎干細(xì)胞成骨分化；Kim等〔18〕證實(shí)TCS可通過(guò)活化ERK途徑乳腺癌細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果提示TCS確實(shí)通過(guò)ERK/NF-κB通路發(fā)揮作用。

綜上，TCS暴露可能通過(guò)激活ERK/NF-κB信號(hào)通路而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲，提示TCS作為潛在的EDC，有可能加速卵巢癌的進(jìn)展，并對(duì)人類健康構(gòu)成威脅，有必要加以重視。