高秋珍 朱鳳蓮 張建新

(1許昌學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 許昌 461000；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)院)

急性肺損傷(ALI)是一種臨床常見且病死率高的危重病癥，是由直接或間接原因造成肺上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，肺毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致急性缺氧性呼吸衰竭，肺內(nèi)抗炎與促炎因子比例失調(diào)〔1〕。其臨床癥狀為發(fā)熱、咳嗽、痰中帶血，部分患者伴有呼吸困難或胸痛，ALI發(fā)展至嚴(yán)重階段被稱為急性呼吸窘迫綜合征。該疾病臨床治療困難，尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化的治療方法，現(xiàn)有的臨床治療方案尚不能取得令人滿意的效果。ALI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，炎癥反應(yīng)在ALI發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中起著重要作用〔2〕。因此，探尋新的有效可行的治療手段成為科研工作者和臨床醫(yī)生面臨的重大挑戰(zhàn)。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是來(lái)源于中胚層和神經(jīng)外胚層的前體細(xì)胞，具有自我更新和免疫調(diào)節(jié)作用〔3〕。該細(xì)胞最早發(fā)現(xiàn)于骨髓，后來(lái)在臍帶血、胚胎、脂肪、肝臟、牙周等細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)，幾乎涵蓋了人體的所有器官與組織，具有取材方便、容易分離培養(yǎng)增殖的特點(diǎn)，因而在創(chuàng)傷修復(fù)、免疫治療及組織功能重建等領(lǐng)域應(yīng)用前景極為廣闊〔4〕。既往研究〔5〕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MSCs對(duì)眾多免疫細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用，它通過(guò)分泌趨化因子和細(xì)胞因子發(fā)揮作用。有研究表明，MSCs對(duì)炎癥性疾病的治療起著重要作用〔6〕，可減輕ALI患者肺部炎癥并增強(qiáng)肺泡液體清除能力，對(duì)肺部疾病有治療作用，MSCs已成為ALI的一種有前景的治療方法。但目前關(guān)于應(yīng)用人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(hPMSCs)治療ALI的研究較少，因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究hPMSCs對(duì)ALI患者的免疫調(diào)節(jié)作用，為hPMSCs應(yīng)用于治療ALI提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人胎盤組織取自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)院產(chǎn)科臨床足月剖宮產(chǎn)胎盤，產(chǎn)婦及家屬均知情同意并簽署知情同意書。本項(xiàng)研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑與儀器 胎牛血清(FBS，鄭州九龍生物制品有限公司)；HBSS、DEEM和磷酸鹽緩沖液(PBS,Gibco公司)；無(wú)鈣鎂磷酸鹽緩沖液(PBS-CMF)；DNA酶Ⅰ(Roche公司)；A型膠原酶(北京盛科博源生物科技有限公司)；CD14-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC、CD73-PE、CD105-PE鼠抗人單克隆抗體 IgG2a-FITC、IgG1-PE、CD8-PE、CD4-FITC及儀器流式細(xì)胞儀(BD公司產(chǎn)品)，白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，北京廣源恒信科技發(fā)展有限公司)，胰蛋白酶和絲裂霉素C〔今品化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司〕，倒置顯微鏡(Olympus公司)，電子天平(PB303-E型，梅德勒公司)，全自動(dòng)高壓鍋，CO2培養(yǎng)箱，移液槍，大中小槍頭，10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，96孔板細(xì)胞培養(yǎng)皿，24孔板細(xì)胞培養(yǎng)皿。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1hPMSCs的分離與培養(yǎng) 將獲取的胎盤無(wú)菌轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，用PBS漂洗3～4次后，將組織剪成0.5 cm厚的組織，然后用眼科剪將組織塊剪成1 mm3的碎塊，用PBS緩沖液洗滌3～4次，加入1 μg/ml DNA酶Ⅰ、0.1%A型膠原酶，在37℃恒溫水浴鍋中消化2 h。收集上清液，用100目細(xì)胞篩網(wǎng)篩除殘留的大塊組織，540 r/min離心5 s，收集上清液。加入100 ml/L的培養(yǎng)基懸重沉淀，接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。48 h換液，換液時(shí)用PBS多洗幾次，并于第2天開始密切關(guān)注細(xì)胞生長(zhǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度為85%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取3代hPMSCs細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2hPMSCs特異性抗原鑒定 選取第3代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hPMSCs細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶液消化5 min后將細(xì)胞漂洗3次，接著用300目濾膜過(guò)濾。調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×107/ml并分裝，每支流式細(xì)胞管加入0.1 ml細(xì)胞，然后加入CD45、CD14、CD90、CD34、CD105、CD73及HLA-DR-FITC等流式抗體，靜置15 min后PBS重懸，加入PBS制成細(xì)胞懸液，最后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.3hPMSCs與ALI患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNCs)共培養(yǎng) 將hPMSCs置于37℃恒溫水浴鍋中，加25 mg/L絲裂霉素C預(yù)處理30 min。調(diào)整細(xì)胞濃度，將hPMSCs以1×105個(gè)/孔接種于24孔板。抽取ALI患者晨起空腹靜脈血，采用Ficoll密度梯度離心法分離，得到PBMNCs。用RPMI1640培養(yǎng)液將其洗滌3次后，將PBMNCs以1×106個(gè)/孔接種到上述24孔板中，并加入10 μg/ml植物凝集素(PHA)，分為4組：PBMNCs組，PBMNCs+PHA組，hPMSCs+PBMNCs組，hPMSCs+PBMNCs+PHA組，每組3個(gè)重復(fù)樣本；置于培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中培養(yǎng)。

1.3.4MTT法檢測(cè)hPMSCs+PBMNCs細(xì)胞增殖 將hPMSCs+PBMNCs細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔板，分為4組：空白組(等量培養(yǎng)液)，PBMNCs組，PBMNCs+PHA組，hPMSCs+PBMNCs+PHA組，每組3個(gè)復(fù)孔，37℃恒溫培養(yǎng)72 h后，各孔加入20 μl MTT(5 g/L)溶液，在37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄凈上清液，每孔加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)，充分溶解后，測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度(A)值。

1.3.5ELISA檢測(cè)hPMSCs+PBMNCs細(xì)胞IL-10、IFN-γ水平1.3.2中hPMSCs+PBMNCs細(xì)胞共培養(yǎng)72 h后，用ELISA法檢測(cè)IL-10、干擾素(IFN)-γ水平，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hPMSCs+PBMNCs細(xì)胞淋巴細(xì)胞亞群1.3.2中hPMSCs+PBMNCs細(xì)胞共培養(yǎng)72 h后，用0.25%胰蛋白酶消化5 min，PBS-CMF漂洗3次，取100 μl(1×107/ml)分裝，然后加入單克隆抗體IgG1-PE、IgG2a-FITC、CD4-FITC、CD8-PE，避光靜置20 min，PBS漂洗3次，最后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1hPMSCs的形態(tài)學(xué)特征 hPMSCs在換液后貼壁生長(zhǎng)，接種48 h換液后只有少量細(xì)胞貼壁，3 d呈分散細(xì)胞克隆，7～10 d細(xì)胞克隆大量繁殖，細(xì)胞直徑增大，細(xì)胞胞質(zhì)透明、核質(zhì)比大、呈渦旋狀生長(zhǎng)。取第3代(P3)hPMSCs于倒置顯微鏡下觀察(圖1)，細(xì)胞形態(tài)均為長(zhǎng)梭形，渦旋式生長(zhǎng)，與成纖維細(xì)胞外觀相似。上述特征符合MSCs典型細(xì)胞形態(tài)。

圖1 hPMSCs的形態(tài)學(xué)特征(×300)

2.2hPMSCs特異性抗原鑒定 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，hPMSCs細(xì)胞表達(dá)CD73、CD90、CD105，不表達(dá)CD14、CD34、CD45和HLA-DR，具有典型MSCs表面標(biāo)志。見圖2。

圖2 hPMSCs表面標(biāo)志檢測(cè)結(jié)果

2.3hPMSCs對(duì)患者PBMNCs增殖的影響 在倒置顯微鏡下，經(jīng)PHA活化的PBMNCs細(xì)胞T細(xì)胞克隆性繁殖，成簇生長(zhǎng)。空白組OD值0.07、PBMNCs組OD值0.60、PBMNCs+PHA組OD值1.26、PBMNCs+PHA+hPMSCs組OD值0.68。PBMNCs+PHA+hPMSCs組與PBMNCs+PHA組比較，PBMNCs細(xì)胞增殖水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4對(duì)患者PBMNCs細(xì)胞IL-10、IFN-γ的影響 PBMNCs+PHA+hPMSCs組細(xì)胞因子IL-10水平顯著高于PBMNCs+PHA組，細(xì)胞因子IFN-γ水平顯著低于PBMNCs+PHA組(均P<0.05)。見表1。

表1 hPMSCs對(duì)患者PBMNCs細(xì)胞IL-10、IFN-γ的 影響

2.5對(duì)患者PBMNCs細(xì)胞T細(xì)胞亞群的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與hPMSCs細(xì)胞共培養(yǎng)后，PBMNCs+hPMSCs組CD4+、CD8+T細(xì)胞水平明顯降低，顯著低于PBMNCs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 hPMSCs對(duì)患者PBMNCs細(xì)胞T細(xì)胞亞群的 影響

3 討 論

近年來(lái)，干細(xì)胞研究與臨床應(yīng)用發(fā)展迅速，受到廣泛關(guān)注。多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家在生命科學(xué)與干細(xì)胞的臨床研究中投入巨大，并取得突破性進(jìn)展。研究表明〔7，8〕，不同種類不同來(lái)源的干細(xì)胞具有不同的生物學(xué)特性，可誘導(dǎo)性不同，可分化為合適的細(xì)胞，分泌各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，對(duì)受損區(qū)域進(jìn)行修復(fù)。

MSCs來(lái)源廣泛，幾乎存在于人體所有組織與器官，比較容易獲得。而且，MSCs具有自我更新、多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)功能及抗炎等特點(diǎn)〔9，10〕，在臨床治療ALI這類目前尚無(wú)有效治療手段的疾病方面有巨大潛能。有研究發(fā)現(xiàn)〔11～13〕，MSCs可向受損、炎癥及腫瘤組織等部位遷移，通過(guò)分泌諸多因子(趨化因子、免疫抑制因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等)，作用于活化的免疫細(xì)胞，修復(fù)損傷部位，抑制炎癥反應(yīng)，參與ALI等疾病的治療。hPMSCs相對(duì)于其他來(lái)源的MSCs，不僅取材容易而且對(duì)人體沒(méi)有傷害，不涉及道德倫理與法律問(wèn)題，是理想的干細(xì)胞治療來(lái)源。

本研究結(jié)果表明hPMSC培養(yǎng)分離成功。Zheng等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞和肺部炎癥因子對(duì)肺部微血管內(nèi)皮可造成破壞作用，進(jìn)而使得內(nèi)皮通透性增加，MSCs可改善炎癥因子對(duì)肺微血管內(nèi)皮的破壞。吳海青等〔15〕用MSC處理ALI小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠炎癥反應(yīng)程度降低，且MSCs移植對(duì)大鼠無(wú)明顯毒副作用。本研究表明hPMSCs可在一定程度上降低ALI患者的炎癥反應(yīng)，抑制T細(xì)胞的免疫反應(yīng)。hPMSCs作為ALI臨床治療策略還有很長(zhǎng)的路要走，最終能否成功可能取決于對(duì)hPMSCs作用機(jī)制的更多了解。