周爽 蔡葉 袁志瑤 王旻

人體口腔內(nèi)存在數(shù)以億計的微生物，這些寄居在口腔各個部位的微生物，其組成和結(jié)構(gòu)變化與口腔健康和疾病息息相關(guān)。口腔內(nèi)微生物群落的變化，會引發(fā)許多口腔疾病，如齲齒、牙周病、牙髓炎、念珠菌感染、種植體感染及正畸體周圍炎等［1］。因此，檢測并判斷口腔內(nèi)微生物組成和群落的變化尤為重要。傅里葉紅外變換光譜（FT-IR）技術(shù)具有靈敏度高、操作方便快捷、采樣量少等優(yōu)點，可以很好地應(yīng)用于口腔特征微生物的研究，該方法還有一個重要的特征是不必對樣品進行化學(xué)處理，只須對微生物進行簡單的干燥壓片，檢測過程簡單且無損。本文應(yīng)用傅里葉紅外變換光譜法（FT-IR）結(jié)合統(tǒng)計學(xué)對口腔內(nèi)特征微生物進行研究。目前，傅里葉紅外光譜應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)細(xì)菌和真菌的鑒別國內(nèi)已有報道［2］。

干燥綜合征（Sj?gren syndrome，SS）是自身免疫性疾病，又稱外分泌腺上皮細(xì)胞炎，自身免疫細(xì)胞對淚腺、唾液腺等外分泌腺體的進行性破壞導(dǎo)致患者主要表現(xiàn)眼干、口干、皮膚干燥等癥狀，并引起機體其它器官受累，甚至影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)［3］。目前干燥綜合征的發(fā)病機制和病理機制仍不明確，患者在患病初期常常被誤診，從而耽誤治療，目前干燥綜合癥無法根治，患者極其痛苦。由于干燥綜合癥患者口腔唾液分泌量降低，唾液的潤滑和抗菌作用減少使得口腔內(nèi)微生物群落發(fā)生明顯改變，臨床上SS患者較正常人群更易患牙齦炎、牙周炎、猖獗齲等微生物感染性疾?。?］。

鑒于干燥綜合癥患者對猖獗性齲的易感性以及林場的難治性，很多醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)W者都投入了相當(dāng)多的關(guān)注，本文選取 5株特征菌株作為對照菌［5－10］，采用傅里葉紅外變換光譜對原發(fā)性干燥綜合癥伴有齲齒患者口腔微生物進行聚類鑒別，為今后椅旁快速檢測干燥綜合癥猖獗性齲患者口腔內(nèi)微生物提供一種簡便快捷的操作方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

數(shù)顯恒溫培養(yǎng)箱BluePard（上海一恒科技有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱RW-30（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；TENSOR-27-HTS-XT傅立葉紅外微生物測量系統(tǒng)、微生物FT-IR圖譜測量專用的B-module附件、DTGS檢測器、ZnSe載樣窗片、電動接種環(huán)、OPUS6.5分析軟件（Bruke公司，德國）；超純水儀（Milipore公司，美國）。

1.2 培養(yǎng)基

PYG液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)；氯化血紅素；微生物K1；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（tryptic soy broth medium，TSB）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（tryptic soy agar culture medi-um，TSA）；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（sabouraud dextrose broth，SDB）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（sabouraud dex-troseagar culture medium，SDA）；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基；乳酸桿菌選擇性瓊脂；輕唾桿菌肽瓊脂（mitis sali-varius bacitracinagar culture medium，MSBA）培養(yǎng)基；MRS瓊脂培養(yǎng)基；巧克力平板培養(yǎng)基；念珠菌顯色培養(yǎng)基；莫匹羅星鋰鹽。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

白色念珠菌 （Candida albicans）［CMCC（F）98001］；發(fā)酵 乳 桿 菌 （Lactobacillus fermentum）；［ATCC 11739］；變異鏈球菌 （Streptococcu mutans Clarke）［ATCC 25175］；干燥奈瑟菌（Neisseia sicca）［ATCC 9913］；短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）［ATCC 15700］。以上菌種由中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌管理保藏中心和中國微生物菌種保藏中心提供，實驗中均使用第3代。

1.4 待測菌株

納入2017年6～12月于南京市鼓樓醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的伴有齲齒SS患者20例，患者均簽署知情同意書。SS的臨床診斷依據(jù)是美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）于 2012年提出的［11］：RF（＋）伴 ANA＞1：320，血清SSA和/或SSB抗體（＋），角結(jié)膜染色評分＞/＝3分，唇腺病理活檢示淋巴細(xì)胞灶≥1個/4 mm2，患者均符合上述標(biāo)準(zhǔn)中的2項。20例SS患者系經(jīng)問卷調(diào)查及臨床檢查后確診，均為女性，年齡45～55歲，首次確診SS，患者自覺眼干，口干后發(fā)現(xiàn)口內(nèi)多顆牙變色、缺損，伴冷刺激敏感，無治療史，病程6個月以上，無其他系統(tǒng)性疾病，如糖尿病、肝炎、結(jié)核等?；颊呖谇粯颖静杉?，囑飲用水漱口，并于取樣前30 min內(nèi)禁止飲食、吸煙、咀嚼口香糖等［12］。采用無菌棉簽刮拭患者齦上近齦緣處菌斑［13－14］，將棉簽立即置于無菌10 mL生理鹽水中，4℃冰箱保存，12 h內(nèi)轉(zhuǎn)種。

1.5 實驗方法

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的純培養(yǎng) 5株標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干菌粉經(jīng)過復(fù)溶、轉(zhuǎn)種復(fù)舒后均采用第3代菌種。根據(jù)菌株不同的生長條件選擇適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，白念接種于平板培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24 h；變異鏈球菌和干燥奈瑟菌于TSA平皿上35℃培養(yǎng)24 h；發(fā)酵乳桿菌于MRS瓊脂平皿中35℃厭氧培養(yǎng)48～72 h；短雙歧桿菌接種于莫匹羅星鋰鹽改良的MRS瓊脂平皿上，35℃厭氧培養(yǎng)48～72 h。

1.5.2 待測菌株的純培養(yǎng) 分別取20例pSS患者唾液樣本各1 mL接種于TSB、SDB、PYG液體培養(yǎng)基和乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，將TSB和SDB置于35℃，培養(yǎng)24 h，PYG液體培養(yǎng)基和乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基置于35℃厭氧培養(yǎng)72 h。TSB培養(yǎng)物分別劃線于MSBA瓊脂平板和巧克力瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)24 h；SDB培養(yǎng)物劃線于SDA瓊脂平板和念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，35℃培養(yǎng)24 h；PYG培養(yǎng)物劃線接種于莫匹羅星鋰鹽改良MRS瓊脂平板上，35℃厭氧培養(yǎng)24 h；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)物接種于乳酸桿菌選擇性瓊脂平板上，35℃厭氧培養(yǎng)24 h。

挑取各分離平板上生長的疑似菌落，20例SS患者唾液樣本共分離培養(yǎng)出9株白色念珠菌疑似菌，12株發(fā)酵乳桿菌疑似菌，9株變異鏈球菌疑似菌，1株干燥奈瑟菌疑似菌，9株短雙歧桿菌疑似菌。挑取典型菌落接種于相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基中進行純培養(yǎng)。

1.5.3 樣品制備 20例pSS患者口腔的提取樣本經(jīng)過增菌、分離培養(yǎng)后，于相應(yīng)的平板培養(yǎng)基上35℃需氧或厭氧培養(yǎng)24 h，標(biāo)準(zhǔn)菌株劃線接種于相應(yīng)的平板培養(yǎng)基中35℃需氧或厭氧培養(yǎng)24 h。采用校準(zhǔn)過的電動鉑金接種環(huán)，從斜面培養(yǎng)基上挑取1～2環(huán)菌苔，置于100μL超純水中制成均勻的菌懸液，取15μL置于ZnSe載樣窗口上，于35℃恒溫干燥培養(yǎng)箱中干燥，直至成透明的菌膜。

1.5.4 傅立葉紅外變換光譜的采集 載有樣品的ZnSe充分干燥后置于樣品倉中，測定傅里葉紅外吸收光譜，光譜范圍選擇：3 000～9 00 cm－1，光譜分辨率為4 cm－1，自動平滑處理。光譜掃描時扣除噪聲、CO2和H2O的干擾。

1.5.5 傅里葉紅外圖譜的處理和分析 按照FT-IR光譜采集SOP的要求，對待測菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株在相應(yīng)的相同條件下培養(yǎng)后，進行光譜采集，每株菌采集3張圖譜，最終取平均得到平均圖譜。不同種類的微生物的FT-IR圖是不同的，真菌的特征區(qū)域光譜范圍根據(jù)各個生物大分子紅外特征譜對于真菌分類的貢獻大小，選定 1 800～1 485、1 485～1 185、1 185～900 cm－1（蛋白質(zhì)、脂類，磷酸鹽化合物、和多糖），細(xì)菌的分類主要體現(xiàn)在細(xì)胞壁多聚糖，細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)、類脂和細(xì)胞膜脂肪酸的吸收上，選擇1 200～900、1 500～1 400、3 000～2 800 cm－13個譜段進行為光譜分析靈敏區(qū)，用于分類和聚類分析［15－16］。

采用聚類分析法對圖譜進行分析，OPUS 6.5分析軟件對圖譜進行歸一化和一階導(dǎo)數(shù)處理，并進行極限校準(zhǔn)，透光率轉(zhuǎn)化，采用離差平方和法（Ward＇s）計算距離，距離越近，兩株菌具有相似性越高［17］。

將上述各菌的3 000～900 cm－1波數(shù)的圖譜進行聚類分析，得到試驗菌和標(biāo)準(zhǔn)菌的聚類分析樹形圖。

2 結(jié) 果

將標(biāo)準(zhǔn)菌株白色念珠菌、發(fā)酵乳桿菌、變異鏈球菌、干燥奈瑟菌和短雙歧桿菌5株標(biāo)準(zhǔn)菌株按照SOP的要求培養(yǎng)后，每株菌采集3張圖譜，剔出掉溢出光譜，從圖1可見（紅色、綠色、紫色、深藍、淺藍分別代表白念、干燥奈瑟菌、短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌和變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌的FT-IR紅外吸收圖譜），它們的傅里葉紅外圖譜各不一樣。將5株菌的FT-IR圖譜經(jīng)過矢量歸一化，一階求導(dǎo)后，特定譜段進行聚類分析，得到樹形圖（圖2），5株菌的差異距離都比較大。

圖1 5株標(biāo)準(zhǔn)菌的傅里葉紅外光譜圖Fig 1 FTIR spectrum of 5 standard bacteria

圖2 5株菌的傅里葉紅外光譜聚類分析距離Fig 2 Cluster analysis distance of 5 strains by FTIR

將患者口腔分離出來的白色念珠菌疑似菌、變異鏈球菌疑似菌、發(fā)酵乳桿菌疑似菌、干燥奈瑟菌疑似菌和短雙歧桿菌疑似菌分別與標(biāo)準(zhǔn)菌株進行比對，紅外圖譜經(jīng)過矢量歸一化，一階求導(dǎo)后進行聚類分析，結(jié)果見圖3～7。

圖3 9株白念疑似菌與白念標(biāo)準(zhǔn)菌聚類分析結(jié)果Fig 3 Cluster analysis results of 9 suspected and standard Candida albicans

圖4 9株變鏈疑似菌與變鏈標(biāo)準(zhǔn)菌聚類分析結(jié)果Fig 4 Cluster analysis results of 9 suspected and standard Streptococcus mutans

圖5 12株發(fā)酵乳桿菌疑似菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株聚類分析結(jié)果Fig 5 Cluster analysis results of 12 suspected and standard strains of Lactobacillus fermentans

圖6 干燥奈瑟菌疑似菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株聚類分析結(jié)果Fig 6 Cluster analysis results of suspected and standard strains of Neisseria sicca

圖7 短雙歧桿菌疑似菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株 聚類分析結(jié)果 Fig 7 Cluster analysis results of suspected and standard Bifidobacterium brevis

3 討 論

SS患者最重要的臨床表現(xiàn)是唾液腺受損，唾液減少，因此唾液的潤滑、清潔和抗菌作用減弱或消失，正?？谇画h(huán)境的改變使得口腔內(nèi)菌群失調(diào)，某些條件致病菌轉(zhuǎn)化為致病菌，引起口腔感染性疾病。本實驗選擇的是五株臨床較為常見的菌株，本研究認(rèn)為在口腔環(huán)境改變下，這些條件致病菌可能轉(zhuǎn)化為致病菌，造成SS患者口腔菌群失調(diào)，并與猖獗齲、黏膜炎癥等疾病存在相關(guān)性。

從SS患者口腔中分離到的疑似菌中，發(fā)酵乳桿菌、變異鏈球菌和白色念珠菌的比例最高，在與標(biāo)準(zhǔn)菌株進行聚類分析之后，變異鏈球菌和白色念珠菌分別有4株和2株與標(biāo)準(zhǔn)菌聚為一類，在選擇性平板上疑似菌生長的大小、顏色形態(tài)和生理特征都與標(biāo)準(zhǔn)菌株相似，因此可以推斷，這些疑似菌可能與標(biāo)準(zhǔn)菌株屬于同一屬，在種水平上存在差異。發(fā)酵乳桿菌、變異鏈球菌和白色念珠菌的檢出率高，我們推測，與干燥綜合癥患者易發(fā)齲病有一定的關(guān)系。

這5株標(biāo)準(zhǔn)菌株與20例SS伴齲齒患者口腔提取物進行紅外光譜比對，能夠快速的鑒別出患者口腔內(nèi)是否含有目標(biāo)菌株，對臨床微生物的快速鑒別有一定的指導(dǎo)意義。

傅里葉紅外變換光譜技術(shù)作為一個全細(xì)胞紅外圖譜信息，能夠快速的鑒定菌株的類別，對于臨床疾病臨床快速檢測具有一定的意義，它利用不同種微生物之間蛋白質(zhì)、磷脂、多糖等結(jié)構(gòu)紅外吸收的不同，光譜存在差異，以此對微生物進行鑒別。光譜的差異性主要表現(xiàn)在吸收峰的位置、強度和峰形上。它的優(yōu)點是操作簡便，成本低，時間短。其局限性在于，利用微生物中所含物質(zhì)的不同來判別光譜的差異性，會受到微生物生長階段、生長環(huán)境等不同因素的影響，影響結(jié)果判斷；另外微生物的鑒別受到對照菌選擇的限制，在今后的研究中，將進一步收集病例，擴大樣本量，不斷地增加傅里葉紅外光譜菌庫范圍，有望實現(xiàn)臨床致病微生物的快速鑒別。