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植物蛋白肽美拉德反應中間體與加香卷煙燃吸品質香氣風格的相關性

2021-07-28 07:12:48
食品與機械 2021年7期
關鍵詞:加香拉德中間體

雷 聲

崔和平2

楊乾栩1

王 凱1

劉志華1

段焰青1

王 晉1

張曉鳴2

(1. 云南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心,云南 昆明 650231;2. 江南大學食品學院,江蘇 無錫 214122)

卷煙煙氣的香味是體現(xiàn)卷煙燃吸品質與風格的重要指標。理想的卷煙香氣通常由合理的葉組配方獲得,然而在煙草工業(yè)中,往往需要針對卷煙產(chǎn)品風格特征,向卷煙中添加一定的香精香料,供其加香矯味,強化煙氣特征香氣,賦予卷煙優(yōu)美舒適的口味,不僅可以掩蓋卷煙燃燒產(chǎn)生的雜氣,而且可以消除不同等級煙葉之間的差異并使其相互協(xié)調[1-3]。此外,煙用香精香料的加入還可為卷煙提供清香、濃香、甜香、花香、水果香、堅果香等不同風格,滿足不同消費者的需要。美拉德反應產(chǎn)物是卷煙加香的常用香料,對卷煙香氣質、香氣量、雜氣、刺激性和余味有明顯的改善作用,而且烘烤香、焦香顯著,在強化卷煙特征香氣、提高卷煙燃吸品質方面產(chǎn)生良好的應用效果[4-6]。

美拉德反應產(chǎn)物在卷煙中良好的加香效果一方面是因為其作為煙草加工及卷煙燃燒過程中形成的重要香氣物質,與煙草本味協(xié)調性良好[7-9];另一方面,美拉德反應產(chǎn)物揮發(fā)性較強,對卷煙頭香貢獻顯著[7]。然而,其較強的揮發(fā)性會帶來加香效果不穩(wěn)定的問題,使美拉德反應煙用香精的應用受到限制[10-11]。針對這一問題,可以采用穩(wěn)定的美拉德反應香味前體物替代完全美拉德反應產(chǎn)物應用于卷煙加香,在卷煙燃燒的過程中繼續(xù)完成后續(xù)美拉德反應形成香氣[1,4,12]。美拉德反應初期,糖與氨基酸或肽發(fā)生羰氨反應,通過脫水縮合形成希夫堿,進一步發(fā)生分子重排形成Amadori重排產(chǎn)物(ARP)或Heyns重排產(chǎn)物(HRP)[13-15]。ARP和HRP是理化性質較穩(wěn)定的美拉德反應中間體,是香氣物質形成的重要前體物,可以作為完全美拉德反應產(chǎn)物的替代物對卷煙進行加香,保證卷煙制品在加工、貯藏過程中維持良好的加香穩(wěn)定性,應用前景廣闊[4]。

在農(nóng)產(chǎn)品加工過程中,如大豆、葵花籽油脂的提取及玉米淀粉的生產(chǎn),會同時形成大量富含蛋白質的副產(chǎn)物,這些副產(chǎn)物通常作為優(yōu)質飼料用于禽畜養(yǎng)殖,或者直接作為工業(yè)廢渣排放,直接導致了蛋白資源價值流失甚至環(huán)境污染的問題。研究擬以玉米蛋白、葵花籽蛋白、小麥面筋蛋白、大豆蛋白以及花生蛋白等植物蛋白為原料,利用不同種類的酶對其水解以獲得小分子肽,再將其作為氮源制備美拉德反應中間體,并應用于卷煙加香。

在高溫水相美拉德反應過程中,美拉德反應中間體一旦形成就會迅速降解完成次級反應,很難被捕捉并穩(wěn)定制備。對于植物蛋白酶解產(chǎn)物的混合肽體系,更不可能通過HPLC外標分析法對中間體的形成進行追蹤分析[16]。因此,研究擬采用二階段變溫美拉德反應方法[17],通過找到美拉德褐變抑制最有效的時間點,確定中間體水相形成條件,達到對中間體形成示蹤的目的,進一步采用低溫水相美拉德反應對中間體進行制備。將制備得到的肽美拉德中間體添加至卷煙中進行感官評吸,以煙氣口腔刺激/舌部灼燒、口腔殘留/干燥感、收斂、喉部刺激、喉部干燥、鼻腔刺激、香氣、豐富性、細膩/柔和/圓潤、雜氣、煙氣濃度、勁頭作為卷煙品質特征指標,以烤煙煙香、晾曬煙香、豆香、可可香、奶香、膏香、清香、果香、辛香、藥草香、烘焙香、木香、青滋香、花香、甜香為煙氣香氣風格指標,采用偏最小二乘回歸分析法(PLSR)對加香卷煙品質特征及香氣風格特征進行主成分分析,明確肽美拉德反應中間體制備條件對香氣風格的貢獻性,闡明卷煙燃吸品質與中間體制備條件之間的相關關系,為肽美拉德反應中間體在卷煙加香中的應用提供理論依據(jù)與技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

小麥面筋蛋白、玉米蛋白粉、葵花籽蛋白粉、脫脂豆粉、花生蛋白粉:食品級,安徽強旺調味食品有限公司;

L-半胱氨酸、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-木糖、NaOH、百花蜜、椴樹蜜、荊條蜜、洋槐蜜、棗花蜜:市售;

堿性蛋白酶(2.3×105U/g)、風味蛋白酶(3.4×104U/g):生物級,諾維信生物技術有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

電子天平:EL104型,梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;

磁力攪拌器:C-MAG-HS7型,德國IKA公司;

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:DF-101S型,鞏義市予華儀器有限責任公司;

實驗室pH計:FE20型,梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;

恒溫恒濕培養(yǎng)箱:HWS-150型,上海森信實驗設備有限公司;

紫外可見分光光度計:UV-1800型,島津科學儀器(中國)有限公司。

1.2 分析方法

1.2.1 植物蛋白肽的制備 取適量過80目篩的蛋白粉,按m蛋白粉∶m水=1∶10添加去離子水并混合均勻。在90 ℃下加熱30 min以滅活樣品內源酶,冷卻后調節(jié)溶液pH至8,添加一定量堿性蛋白酶或者堿性蛋白酶與風味蛋白酶的組合,在酶最適溫度下進行水解。反應結束后立即在沸水浴中攪拌加熱15 min,冷卻,于4 300 r/min離心10 min,上清液即為蛋白肽,在-20 ℃下保存待用。

1.2.2 二階段變溫美拉德反應 參照Cui等[17]的方法進行二階段變溫美拉德反應。取適量蛋白肽分散液與還原糖按照糖肽比(m酶解液∶m還原糖)為100∶15混合均勻,采用6 mol/L NaOH溶液調節(jié)溶液pH至7,進行二階段變溫美拉德反應。第一階段(低溫階段):將溶液分裝在耐壓反應瓶中,于90 ℃條件下反應不同時間后,取出冷卻;第二階段(高溫階段):添加質量分數(shù)1.00%半胱氨酸,并重新調節(jié)pH至7,然后將溶液的溫度迅速升高至120 ℃,油浴加熱110 min后,立即將反應液置于冰水中終止反應。所得變溫美拉德反應產(chǎn)物用于褐變指數(shù)測定。

1.2.3 褐變指數(shù)的測定 波長420 nm處的吸光度能反映樣品中類黑素的含量,因此美拉德反應產(chǎn)物的褐變指數(shù)通常用其在420 nm處的吸光度值(A420 nm)來表示[18]。采用紫外可見分光光度計測定變溫美拉德反應液的褐變指數(shù)A420 nm。

1.2.4 美拉德反應中間體的制備 通過測量二階段變溫美拉德反應終產(chǎn)物的褐變指數(shù)(A420 nm),找到色澤最淺的反應液樣品,確定該樣品的低溫反應條件即為美拉德反應中間體形成的臨界條件。參照試驗方法1.2.2配制反應液,在美拉德反應中間體形成的臨界條件下進行反應,反應結束后立即在冰水中終止反應,即得到美拉德反應中間體。將反應液進行冷凍干燥即得中間體固體產(chǎn)品。

1.2.5 蛋白溶出率的測定 蛋白質含量測定按GB 5009.5—2016的凱氏定氮法執(zhí)行。根據(jù)式(1)計算蛋白溶出率。

(1)

式中:

DR——蛋白溶出率,%;

m1——上清液中蛋白質含量,g;

m0——原料中蛋白質含量,g。

1.2.6 水解度的測定 采用甲醛滴定法測定植物蛋白酶解產(chǎn)物中氨基氮含量,按式(2)計算水解度[19]。

(2)

式中:

DH——水解度,%;

C——氫氧化鈉標準溶液濃度,mol/L;

V1——樣品溶液在加入甲醛后滴定至終點所消耗的NaOH標準溶液的體積,mL;

V2——空白溶液在加入甲醛后滴定至終點所消耗的NaOH標準溶液的體積,mL;

V——酶解上清液的體積,mL;

10——取樣體積,mL;

m1——樣品質量,g;

N——原料中蛋白質含量,%;

9.20——每克蛋白質所含的肽鍵毫摩爾數(shù),mmol/g。

1.2.7 卷煙試驗樣品的制備 向煙絲中添加肽美拉德反應中間體溶液,加香量(以中間體與煙絲的質量分數(shù)計)為0.1‰。采用注射加香機將香料單體以一定濃度注射到煙支中心,制成加香卷煙樣品。將得到的試驗煙放在(22±1) ℃、濕度(60±2)%的恒溫恒濕箱中平衡48 h以上,控制煙支質量為0.82 g,平均質量偏差在±0.02 g內,備用于感官品質評吸。

1.2.8 卷煙感官評吸方法 感官評吸由9名省級以上卷煙感官評吸專家完成。參考GB/T 16447—2004《煙草和煙草制品調節(jié)和測試的大氣環(huán)境》調節(jié)卷煙樣品的水分,制備樣品。參考YC/T 497—2014《卷煙中式卷煙風格感官評價方法》對各卷煙樣品的品質特征、風格特征進行評分,中式卷煙風格的感官評價方法包含卷煙產(chǎn)品的燃吸品質特征(包括舒適感特性,煙氣特性)和風格特征(包括風味特征,香氣風格)共27個指標。卷煙燃吸品質特征和評吸香氣風格評分標準分別見表1和表2。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 所有試驗重復至少3次,試驗結果表示為平均值±標準偏差。數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016、SPSS Statistic 22.0 軟件,通過鄧肯多重范圍檢驗進行統(tǒng)計分析,篩選去除異常數(shù)據(jù),以P<0.05表示數(shù)據(jù)間顯著性差異。利用Unscrambler 9.7軟件對卷煙燃吸品質、特征香氣成分、肽美拉德反應中間體制備條件之間進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 美拉德反應中間體的水相制備

分別采用玉米蛋白(C)、葵花籽蛋白(K)、小麥面筋蛋白(G)、大豆蛋白(S)以及花生蛋白(P)進行酶解處理,通過改變酶解條件,得到不同水解度的酶解液。蛋白原料不同、水解酶不同,得到的水解產(chǎn)物水解度和固形物含量也不同,水解度和固形物含量如表3所示。

將不同水解度和固形物含量的蛋白酶解物與阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、果糖及木糖等還原糖或蜂蜜共熱反應,m酶解液∶m還原糖=100∶15,以半胱氨酸為示蹤劑,通過二階段變溫美拉德反應確定中間體形成的臨界條件。

表1 卷煙燃吸品質特征指標評分標準

表2 卷煙香氣風格指標評分標準

反應分成兩個階段:第一階段反應溫度90 ℃,反應時間0~140 min,然后加入半胱氨酸開始第二階段反應,將反應溫度升高至120 ℃,反應110 min。測定變溫反應終產(chǎn)物的A420 nm,發(fā)現(xiàn)在第一階段反應60 min時添加半胱氨酸,變溫美拉德反應產(chǎn)物的A420 nm值均為最低,不同體系的試驗結果一致。說明玉米蛋白、葵花籽蛋白、小麥面筋蛋白、大豆蛋白等植物蛋白肽美拉德反應中間體形成的臨界條件為90 ℃、60 min。在此條件下進行低溫美拉德反應,制備不同體系的肽美拉德反應中間體,不同中間體樣品的編號如表3所示。

表3 肽美拉德反應中間體樣品編號及其制備條件?

2.2 加香卷煙燃吸品質特征主成分及其與中間體制備條件的相關性

將C、K、G、S、P 5組不同樣品分別通過注射加香添加至某云煙品牌煙絲中,添加量為煙絲重量的0.1‰。美拉德反應中間體在卷煙燃燒過程中發(fā)生后續(xù)美拉德反應,產(chǎn)生香氣物質,強化卷煙特征吃味、圓和煙氣。對添加中間體的卷煙進行感官評吸,其燃吸品質特征得分如表4所示??傮w來看,C系列樣品的評分高于其他系列樣品,表明玉米肽美拉德反應中間體比其他植物蛋白肽美拉德中間體的卷煙加香作用更顯著。

表4 卷煙樣品的燃吸品質特征得分

續(xù)表4

為明確卷煙燃吸品質特征指標與肽美拉德反應中間體制備條件的相關關系,采用PLSR方法對兩者的量化結果進行分析。PLSR是一種重要的相關性分析方法,與主成分回歸有關系,但不是尋找響應和獨立變量之間最小方差的超平面,而是通過投影預測變量和觀測變量到一個新空間來尋找一個線性回歸模型[20]。由于變量X和Y都投影至新空間,PLS系列的方法都是雙線性因子模型,當Y是分類數(shù)據(jù)時進行偏最小二乘判別分析。PLS用于查找兩個矩陣(X和Y)的基本關系,即一個在這兩個空間對協(xié)方差結構建模的隱變量方法。PLS模型將試圖找到X空間的多維方向來解釋Y空間方差最大的多維方向。PLSR特別適合當預測矩陣比觀測的有更多變量,以及X的值中有多重共線性的時候。相比之下,除吉洪諾夫正則化情況外,標準的回歸分析在這些情況下效果不理想。以加香卷煙的12個品質特征指標為變量進行主成分(PCA)分析。通過PCA分析,品質特征的12個指標的變量信息被第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)代替,兩個主成分共同解釋了原始變量信息的69%,結果見圖1。

主成分分析中的主成分都是由原始變量線性組合而來,組合系數(shù)的大小反映了原始變量對各個主成分影響的程度。從圖1可以看出,所有特征指標均未位于原點附近,皆有對兩個主成分的貢獻;勁頭位于縱坐標PC2的上方,對PC2的貢獻較大,對PC1的貢獻則較小。12個品質特征指標均位于橫坐標右側,對PC1的貢獻較大,說明這12個品質特征指標之間具有較強關聯(lián)性。

從品質特征來看,51個卷煙樣品分成品質特征得分較高的一類(C1’、C4’、P4、ND、C2’、C6’),品質特征得分較低的一類(G7、G5、S5、G6、K2)。樣品G7、G5位于最左側,離卷煙品質特征指標最遠,是卷煙中品質最差的。由以上分析知:卷煙品質特征指標之間有較強協(xié)調性;卷煙品質特征能夠區(qū)分出卷煙的品質高低;以大豆肽、葵花籽肽作為氮源進行美拉德反應形成的中間體普遍使卷煙存在口腔和喉部刺激大、收斂大、香氣不足、煙氣豐富性欠佳等問題;采用玉米肽作為氮源的美拉德反應中間體使卷煙具有口腔刺激小、煙氣柔和圓潤、香氣足、雜氣少的特點,與評吸結果一致。

C1、C2、C3、C4等的坐標值分別代表樣品C1、C2、C3、C4和其余卷煙樣品在PC1和PC2上的得分

采用PLSR分析法分析肽美拉德反應中間體制備條件與品質特征的相關關系,作為一種雙線性模型分析方法,PLSR可同時實現(xiàn)對自變量矩陣(X)和因變量矩陣(Y)的潛變量映射變換。PLSR分析分為單因變量(PLS1)回歸分析和多因變量(PLS2)回歸分析兩種,前者適用于只有一個因變量存在時的相關分析,后者適用于2個或2個以上因變量存在的分析。PLS1即貢獻性分析,一次只能對一個因變量進行解釋和預測。PLS2是多因變量回歸分析,能消除因變量之間存在的多重共線性,當因變量數(shù)目較多且相互之間關系較復雜時,使用PLS2更有優(yōu)勢。在進行具體數(shù)據(jù)分析,常常結合使用PLS2和PLS1。首先通過PLS2分析快速判斷自變量對因變量的整體影響,進而根據(jù)PLS2分析結果,針對性地對變量進行PLS1分析。以常規(guī)化學成分為X變量矩陣,卷煙品質特征為Y變量矩陣進行PLS2相關性分析,并建立模型,結果見圖2。

由圖2可知,模型中前兩個主成分累積提取了X變量92%的信息和Y變量4%的信息。水解度、蛋白溶出率及使用酶的數(shù)量在左側,對卷煙的品質特征產(chǎn)生負面影響。為進一步明確肽美拉德反應中間體制備條件對煙氣特性的影響關系,對煙氣特性的每個指標進行PLS1分析,結果見圖3。

小橢圓代表50%的解釋方差,大橢圓代表100%的解釋方差;小圓圈標注代表存在顯著相關性(P<0.05)

圖3 肽美拉德反應中間體制備條件對其加香卷煙煙氣特性的貢獻性分析(PLS1)

由圖3可知,蛋白溶出率與口腔刺激/舌部灼燒、收斂、喉部干燥、勁頭呈顯著正相關,與口腔殘留/干燥感、喉部刺激、鼻腔刺激、香氣、豐富性、細膩/柔和/圓潤、雜氣、煙氣濃度呈顯著負相關;而水解程度亦即酶的種數(shù)對各個燃吸品質指標沒有相關性??梢姡糜谶M行美拉德反應的底物蛋白肽濃度是調控美拉德反應中間體對卷煙燃吸品質影響的最關鍵因素,實際應用時應考慮采用蛋白溶出率大的蛋白肽進行美拉德反應中間體的制備并將其應用于卷煙加香。

2.3 加香卷煙香氣風格特征主成分及其與中間體制備條件的相關性

為進一步探索添加不同中間體的卷煙香氣風格指標之間的相互影響及其對不同肽中間體的卷煙香韻分類情況,以評吸香氣風格(表5)為變量對施加了美拉德反應中間體的卷煙樣品進行PCA分析,結果見圖4。

由圖4可知,PC1和PC2僅代表了嗅香香氣風格變量的32%的信息,各個指標及卷煙樣品在主成分分析圖上也較為分散,可能是由香氣風格指標較多且相互之間協(xié)同作用較弱導致的;由圖2也可以明顯看出樣品CJ、NJ和CY的評吸香氣風格類似,甜香和花香都比較突出;果香、膏香、豆香和清香距離相對較近,說明4種評吸香韻風格可能具有一定的協(xié)同作用[21],奶香和藥草香距離較近,說明這兩種評吸香韻風格可能具有一定的協(xié)同作用,產(chǎn)生奶香的物質在一定程度上也能產(chǎn)生藥草香。該研究結果表明不同的香型會存在同源情況,即同一種物質或同一類物質的協(xié)同將引起兩個或多個香型的同時出現(xiàn)。

表5 卷煙樣品的評吸香氣風格得分?

續(xù)表5

以美拉德反應中間體制備時蛋白水解度、蛋白溶出率及使用酶的數(shù)量為X變量矩陣,評吸香氣風格烤煙煙香、清香、果香、辛香、木香、青滋香、花香、藥草香、豆香、可可香、奶香、膏香、烘焙香、甜香為Y變量矩陣,對兩者進行PLS2分析建立模型,結果如圖5。

圖4 基于香氣風格的卷煙樣品主成分分析

由圖5可知,模型對X變量的解釋率為93%,對Y變量的解釋率為14%,因此主要從X軸距離判定不同樣品的差異性。青滋香和木香位于橢圓最左側,可可香和奶香位于橢圓最右側:水解度、蛋白溶出率及加酶量與可可香、奶香呈正相關。對評吸香氣風格青滋香、木香、烘焙香、烤煙煙香等進行PLS1分析,結果如圖6所示。

由圖6可知,水解度與烤煙煙香、清香、木香、青滋香、花香、可可香呈顯著負相關,與果香、辛香、藥草香、豆香呈顯著正相關。蛋白溶出率與烤煙煙香、清香、藥草香、豆香、可可香呈顯著正相關,與果香、辛香、木香、青滋香、花香呈顯著負相關。水解度越高,水解產(chǎn)物的分子量越小,因此更容易發(fā)生美拉德反應[22],尤其通過Strecker降解形成吡嗪強化烘烤香、形成Strecker醛強化青滋香和花香。如果美拉德反應程度弱,則烘烤香弱化,酯類物質或呋喃類物質的形成相對增強,對果香、藥草香和豆香的強化作用提高。蛋白溶出率越高,美拉德反應越容易發(fā)生,因此與水解度對卷煙香韻的影響關系相似,然而還可以發(fā)現(xiàn)不同之處,蛋白溶出率較高而水解度較低時,酶解產(chǎn)物濃度較高但是以相對分子質量較大的肽形式存在,該條件下藥草香和豆香得以強化,說明藥草香和豆香的形成與相對分子量較大的肽的美拉德反應有關;在蛋白溶出率較低而水解度較高時,大量的酪氨酸R基暴露,在美拉德反應過程中易發(fā)生交聯(lián),引起酚類聚合物的形成,導致木香氣味的產(chǎn)生。根據(jù)該研究結果,可以針對不同的卷煙產(chǎn)品香韻特征,通過調節(jié)水解度和蛋白溶出率制備不同的肽美拉德反應中間體強化不同的卷煙香氣風格。

圖5 美拉德反應中間體制備條件與香氣風格的相關性分析

圖6 美拉德反應中間體制備條件對香氣風格的貢獻性分析(PLS1)

3 結論

利用堿性蛋白酶和風味蛋白酶在不同的工藝條件下對玉米蛋白、葵花籽蛋白、小麥面筋蛋白、大豆蛋白進行水解,得到植物蛋白肽,再通過二階段變溫美拉德反應明確了肽美拉德反應中間體形成的條件為90 ℃、60 min,在此條件下進行熱反應制備的肽美拉德反應中間體添加至卷煙中,發(fā)現(xiàn)中間體能夠強化卷煙特征吃味、圓和煙氣,具有良好的加香矯味效果,其中玉米肽美拉德反應中間體增香效果最理想。植物蛋白酶解后的蛋白溶出率與煙氣口腔刺激/舌部灼燒、收斂、喉部干燥、勁頭呈顯著正相關,與口腔殘留/干燥感、喉部刺激、鼻腔刺激、香氣、豐富性、細膩/柔和/圓潤、雜氣、煙氣濃度呈顯著負相關。用于進行美拉德反應的底物蛋白肽濃度是調控美拉德反應中間體對卷煙燃吸品質影響的最關鍵因素。水解度與烤煙煙香、清香、木香、青滋香、花香、可可香呈顯著負相關,與果香、辛香、藥草香、豆香呈顯著正相關。蛋白溶出率與烤煙煙香、清香、藥草香、豆香、可可香呈顯著正相關,與果香、辛香、木香、青滋香、花香呈顯著負相關??梢葬槍Σ煌木頍煯a(chǎn)品香韻特征,通過調節(jié)水解度和蛋白溶出率制備不同的肽美拉德反應中間體強化不同的卷煙香氣風格。

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