牛倩倩

許 馨1,2

曾雪瑩1,2

鐘海雁1,2

徐友志1,2

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2. 稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004)

目前，對植物油中脂肪酸分析檢測的方法主要有氣相色譜法[1-2]、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法[3]、高效液相色譜法[4]，這些方法在分析之前都需要將沸點(diǎn)較高的脂肪酸類物質(zhì)衍生為沸點(diǎn)較低的甲酯化合物[5]，而在這個過程中會產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物，并且存在反應(yīng)不完全的問題。目前對植物油脂肪酸含量分析大多采用峰面積歸一法[6]，即通過傳統(tǒng)方法得到的都是植物油中脂肪酸的相對含量，并非絕對含量。因此，傳統(tǒng)方法在靈敏度、選擇性以及脂肪酸定量方面都存在一定缺陷。

蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)的響應(yīng)不依賴于樣品的光學(xué)性質(zhì)。因此樣品無需衍生化[7]。與傳統(tǒng)的脂肪酸分析技術(shù)相比，蒸發(fā)光散射檢測器具有廣泛的溶劑和梯度兼容性，可以提高分析的分辨率和速度[8]。研究擬用高效液相色譜與蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用方法對植物油中脂肪酸含量與種類進(jìn)行分析，以期準(zhǔn)確快速測得植物油中脂肪酸的絕對含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

十四酸、軟脂酸、亞麻酸、亞油酸、油酸、硬脂酸、花生酸、芥酸、山崳酸標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，阿拉丁試劑有限公司；

山茶油、菜籽油：湖南巴陵油脂有限公司；

正己烷、甲醇、氫氧化鉀：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

鹽酸：分析純，株洲市星空化玻有限公司；

甲醇、甲酸：色譜純，美國天地有限公司；

DMSO：分析純，阿拉丁試劑有限公司；

氨水：色譜級，阿拉丁試劑有限公司；

色譜柱：CNW?C18-WP(4.6 mm×250 mm，5 μm)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：FA2204A型，常州幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-S24S型，金壇市大地自動化儀器廠；

微型旋渦混合儀：WH-3型，上海滬西分析儀器廠有限公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津株式會社；

Alltech ELSD檢測器：2000ES型，美國GRACE公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：CNW?C18-WP(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脫條件：0～20 min，B相由85%升至90%；20～40 min，B相保持90%；40～75 min，B相由90%升至100%；75～80 min，B相保持100%；流速：1.0 mL/min；柱溫箱溫度：25 ℃；進(jìn)樣量：30 μL。檢測器設(shè)定條件為：蒸發(fā)光檢測器漂移管溫度為75 ℃；無油空氣泵提供載氣，流速為2.0 L/min；增益設(shè)為4。

1.2.2 流動相條件的優(yōu)化 在HPLC系統(tǒng)中，流動相pH會影響色譜保留行為。為了使各脂肪酸達(dá)到更好的分離效果，用色譜純的氨水調(diào)節(jié)0.1%甲酸水溶液，使溶液pH為2.42，3.92，4.32，4.52。同時在0.1%甲酸甲醇溶液中分別加入等量的氨水。對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和討論，得到對色譜分離效果最佳的pH和梯度洗脫程序。

1.2.3 線性關(guān)系考察 準(zhǔn)確稱取各脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品0.150 g至10 mL容量瓶中，根據(jù)脂肪酸特性，分別將十四酸、軟脂酸、亞麻酸、亞油酸、油酸、硬脂酸和芥酸用DMSO，花生酸用氯仿，山崳酸用四氫呋喃溶解并定容，得到各脂肪酸儲備液。將各脂肪酸儲備液梯度稀釋成不同濃度，再分別用0.22 μm的濾膜過濾后裝入進(jìn)樣瓶中，并依次按照優(yōu)化后的色譜條件及蒸發(fā)光散射檢測器工作參數(shù)進(jìn)行測定(每個樣品重復(fù)測定3次后取其峰面積的平均值)。根據(jù)得到峰面積與其對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別取對數(shù)后進(jìn)行線性回歸并繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 穩(wěn)定性及重現(xiàn)性考察 根據(jù)表1用10 mL的容量瓶配制各脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的甲醇溶液。然后用0.22 μm的濾膜過濾后裝入液相色譜進(jìn)樣瓶。分別于進(jìn)樣后0.0，1.5，3.0，6.0，9.0，15.0 h時對各脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液用優(yōu)化好的色譜條件及檢測器工作參數(shù)進(jìn)行進(jìn)樣測定，利用峰面積的變化，來判斷該方法的穩(wěn)定性；對各脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液用所有優(yōu)化好的色譜條件及檢測器工作參數(shù)連續(xù)進(jìn)樣測定6次，利用峰面積的變化，來判斷該方法的重現(xiàn)性。

1.2.5 最小檢測限考察 將各脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行不斷稀釋，以色譜峰信號強(qiáng)度與噪音比值(信噪比S/N)為3～4為各脂肪酸的最低檢測限(LOD)。

1.2.6 加標(biāo)回收率考察 取9份山茶油樣品，分別添加相較于初始濃度約為80%，100%，120%的9種混合脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)樣品加入到3份平行樣品中，混勻過濾裝瓶，用優(yōu)化后的色譜條件對每個樣品進(jìn)行測定，計(jì)算其回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.7 實(shí)際樣品測定 準(zhǔn)確稱取0.1 g山茶油和菜籽油置于不同的具塞試管中，而后加入2 mL配好的0.3 mol/L的KOH甲醇溶液，置于60 ℃水浴中皂化30 min，皂化結(jié)束后冷卻至室溫，加入2 mL的蒸餾水，混勻后用濃度6.0，0.6 mol/L的鹽酸使pH調(diào)至3～4，再加入3 mL正己烷萃取兩次，然后合并正己烷層；用蒸餾水反萃取正己烷相兩次，每次3 mL，合并正己烷層。最后用氮?dú)獯蹈?，加入甲醇定容?0 mL的容量瓶中，搖勻后過濾進(jìn)樣測定。

表1 各脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液數(shù)據(jù)

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相pH優(yōu)化

流動相pH會影響脂肪酸的解離度，因此對流動相pH進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著流動相pH的增加，脂肪酸的分離效果越來越好，尤其對于前兩種脂肪酸。因?yàn)殡S著pH的增加，脂肪酸的解離程度也越大，不同的脂肪酸與色譜柱間的作用力也存在差異性，但在前期試驗(yàn)中，當(dāng)流動相pH進(jìn)一步增大后，后面3種脂肪酸的分離效果變差，故將流動相pH 4.52作為最優(yōu)的色譜分離條件。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 各脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示，各脂肪酸的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和線性范圍如表2所示。結(jié)果表明：各脂肪酸在其線性范圍內(nèi)的R2>0.990 0，說明相關(guān)線性關(guān)系良好，線性范圍寬。

圖1 流動相pH對色譜分離的影響

圖2 各脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 各脂肪酸標(biāo)樣的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和線性范圍?

2.2.2 穩(wěn)定性及重現(xiàn)性考察 將各脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品，分別在不同的時間點(diǎn)進(jìn)樣測定，最終得到各時間點(diǎn)的峰面積，從而判斷該檢測方法的穩(wěn)定性。如表3所示，十四酸、亞麻酸、亞油酸、軟脂酸、油酸、硬脂酸、花生酸、芥酸、山崳酸9種脂肪酸峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于3%，說明在15 h之內(nèi)該檢測方法是穩(wěn)定的。

將各脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，最終得到各次的峰面積，從而判斷該檢測方法的重現(xiàn)性。如表4所示，9種脂肪酸峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于3%，說明該檢測方法重現(xiàn)性高。

2.2.3 最低檢測限 將各脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用優(yōu)化好的色譜條件依次進(jìn)樣檢測，以信噪比為3的各脂肪酸質(zhì)量濃度為最低檢測限，結(jié)果如表5所示。對比梁敏等[9]采用HPLC-RID測定脂肪酸的含量，其最小檢出限僅為1.9～5.0 μg/mL。試驗(yàn)中，各脂肪酸的最低檢測限均在0.07 mmol/L以下，符合試驗(yàn)要求。

2.2.4 加標(biāo)回收率考察 將加標(biāo)后的茶油樣品用優(yōu)化好的色譜條件依次進(jìn)行進(jìn)樣測定，結(jié)果見表6。由表6可知，9種脂肪酸平均加標(biāo)回收率為92.4%～102.3%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于3%，均符合試驗(yàn)要求。說明使用該方法測定茶油中的各脂肪酸是準(zhǔn)確可靠的。

表3 15 h內(nèi)各脂肪酸峰面積的測定結(jié)果及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

表4 各脂肪酸峰面積的測定結(jié)果及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

表5 各脂肪酸的最低檢測限

表6 各脂肪酸加標(biāo)回收率

在優(yōu)化后的色譜條件下，9種脂肪酸均實(shí)現(xiàn)了良好的分離，對其進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明：十四酸、軟脂酸、亞麻酸、亞油酸、油酸、硬脂酸、花生酸、芥酸和山崳酸9種脂肪酸都有較好的線性關(guān)系且線性范圍寬；穩(wěn)定性高(RSD<3%)；重現(xiàn)性好(RSD<3%)；芥酸最低檢測限達(dá)到10-6mol/L，其余脂肪酸的最低檢測限達(dá)到10-5mol/L；回收率符合試驗(yàn)要求(各脂肪酸的平均回收率均為90%～110%)。

2.3 樣品中脂肪酸的分析

將制備的山茶油和菜籽油樣品用優(yōu)化后的色譜條件依次進(jìn)行脂肪酸分析測定。由圖3可知：基于HPLC-ELSD的脂肪酸測定方法對山茶油和菜籽油均呈現(xiàn)良好的分離度，與其他研究結(jié)果類似，山茶油[10]和菜籽油[11]的主要脂肪酸成分為油酸。山茶油和菜籽油的脂肪酸含量如表7所示，此法測得的含量要顯著高于Ma等[12]用GC法測定的總脂肪酸含量(423.41～461.64 mg/mL)，可能是甲酯化產(chǎn)生的副產(chǎn)物導(dǎo)致反應(yīng)不完全造成的。HPLC-ELSD法和其他分析脂肪酸方法的比較如表8所示。

1. 十四酸 2. 亞麻酸 3. 亞油酸 4. 軟脂酸 5. 油酸 6. 硬脂酸 7. 花生酸 8. 芥酸 9. 山崳酸

表7 各油樣中脂肪酸含量

3 結(jié)論

利用高效液相色譜—蒸發(fā)光散射檢測法測定植物油中的脂肪酸。與其他分析脂肪酸比較，該法具有樣品前處理過程簡單、檢測成本低，能得到植物油中脂肪酸絕對含量的優(yōu)點(diǎn)。而且該方法操作過程簡單，無需衍生且能得到植物油中脂肪酸的絕對含量，比氣相色譜法更具優(yōu)勢。用該檢測技術(shù)代替氣相色譜法可提高高級脂肪酸的檢測效率，但只能檢測長鏈脂肪酸(C14～C22)，后續(xù)針對此缺陷也將尋找方法對試樣進(jìn)行一定的前處理減少蒸發(fā)過程對樣品脂肪酸的損失，以期能夠更全面快速測定植物油中的脂肪酸。