張 滸 ，彭安睿 ，鐘佳冀 ，黃 波

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科；2）麻醉手術(shù)科，云南 昆明 650032）

冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)是治療冠心病的重要手段，但靜脈橋再狹窄嚴(yán)重影響了該手術(shù)的預(yù)后，目前臨床針對(duì)橋血管再狹窄主要采用“雙抗血小板治療”，但靜脈橋再狹窄的風(fēng)險(xiǎn)依然很高[1]，一項(xiàng)隨機(jī)臨床試驗(yàn)顯示CABG術(shù)后3個(gè)月，只服用阿司匹林抗血小板治療的患者有14.3%的靜脈橋閉塞，服用阿司匹林加氯吡格雷“雙抗血小板治療”的患者依然有8.4%的靜脈橋閉塞[2]。因此，研究靜脈橋再狹窄的通路機(jī)制對(duì)于尋找新的藥物治療靶點(diǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的家兔40只，體重2.5～3.4 kg，雌雄不限。所選擇的動(dòng)物均符合云南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 主要試劑和儀器

p-p38 抗體試劑盒，購(gòu)自 GeneTex公司；SP-9001 生物素標(biāo)記山羊抗兔 IgG 免疫組化檢測(cè)試劑盒。自動(dòng)真空組織脫水機(jī)（ASP200S，Leica，德國(guó)）；臺(tái)式高速離心機(jī)（18 R，Dynamica Velocity，德國(guó)）；顯微鏡（Olympus，BX43，日本）；分析圖像軟件Image-Pro Plus 6.0（Media Cybemetics，美國(guó)）；酶標(biāo)儀（iMark，Bio-Rad，美國(guó)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

40只家兔隨機(jī)分成2組（n=20）。假手術(shù)組：動(dòng)物麻醉，切開(kāi)頸部皮膚，分離頸靜脈、頸動(dòng)脈，不做移植，關(guān)閉切口。實(shí)驗(yàn)組：按1.4方法建立冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)兔模型。

1.4 冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)兔模型制作

將家兔用 3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）耳緣靜脈給藥麻醉，并予術(shù)中維持靜點(diǎn)。術(shù)前靜點(diǎn)青霉素鈉注射液40萬(wàn)U預(yù)防感染。麻醉后，家兔仰臥位，固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，常規(guī)頸部脫毛，碘伏消毒，無(wú)菌單鋪單，頸部正中切口，長(zhǎng)約8 cm，分離胸骨舌骨肌和胸骨甲狀肌之間的組織，沿兩條肌肉之間可找到頸總動(dòng)脈，鈍性離分頸總動(dòng)脈，長(zhǎng)度約3.5 cm，在頸部皮膚下，胸骨乳突肌的外緣，可見(jiàn)頸外靜脈，游離，上至上頜內(nèi)靜脈分叉處，下至胸骨水平。肝素鈉1 mg/kg 耳緣靜脈注射，全身部分性肝素化，將靜脈兩端分別結(jié)扎，并取下長(zhǎng)約3 cm靜脈，上下兩端用線標(biāo)記。在動(dòng)脈近端，遠(yuǎn)端分別放置無(wú)創(chuàng)血管夾，在頸動(dòng)脈血管兩處分別切取長(zhǎng)約3 mm左右的縱行切口，用8-0prolene無(wú)創(chuàng)縫線順時(shí)針連續(xù)縫合，靜動(dòng)脈形端側(cè)吻合，每個(gè)吻合口處縫合約8～10針。吻合后排氣打結(jié)，放開(kāi)無(wú)創(chuàng)血管夾恢復(fù)血流，然后用0號(hào)棉線將動(dòng)脈兩吻合口中部血管結(jié)扎，動(dòng)脈血流全部自靜脈血管經(jīng)過(guò)，充分止血，分層縫合。術(shù)后肌注青霉素鈉預(yù)防感染，共3 d。動(dòng)物置于清潔，通風(fēng)，溫度適宜環(huán)境中，

1.5 橋血管取材

術(shù)后第2天2組隨機(jī)取10只兔子，剩余的10只兔子飼養(yǎng)到術(shù)后第2周。同法麻醉，實(shí)驗(yàn)組沿原有切口分離出橋血管，切斷橋血管遠(yuǎn)端吻合口動(dòng)脈端，可見(jiàn)有血液噴出，證實(shí)橋血管通暢，對(duì)橋血管中央部位進(jìn)行活體取材。假手術(shù)組按沿原有切口分離頸靜脈，取一段頸靜脈。按實(shí)驗(yàn)方法不同要求分別固定并送檢。

1.6 管腔狹窄程度測(cè)定

靜脈橋組織切片，常規(guī)HE染色，應(yīng)用 Image-Pro Plus 6.0 生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量血管管腔增生程度，以 L1 表示管腔增生厚度，L2 表示管腔厚度，以 L1/L2 比值評(píng)估管腔狹窄程度，單位為百萬(wàn)像素。

1.7 p-p38免疫組化染色

常規(guī)組織切片，二甲苯脫蠟，10 min×2次，然后依次放置在無(wú)水乙醇 I、II、95%、80% 酒精中各 5 min。放置在H2O2室溫中20 min。PBS沖洗3次，放于枸櫞酸鈉高壓鍋熱修復(fù)，取出冷卻，PBS洗沖3次。滴加一抗 p-p38（1∶100）在濕盒中，4 ℃一夜，復(fù)溫到37 ℃1 h；PBS洗3次后，再加二抗，室溫放置30 min；PBS洗3次。滴加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶，37 ℃下孵育20 min；PBS洗3次，滴加DAB顯色劑；自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化、脫水，透明中性樹(shù)膠封片。酶標(biāo)儀上檢測(cè)其吸光密度值（optical density value，OD值），每組中選取8張切片，顯微鏡觀察，在高倍視野下（10×20倍）每張切片選取6個(gè)視野，采用 Imagine-Pro-Plus6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集和定量分析，計(jì)算出所選區(qū)域內(nèi)平均吸光度（平均吸光度=累積吸光度÷有效區(qū)域面積），并取平均值[3]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有計(jì)量資料服從正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，假設(shè)不同水平下，各總體均值無(wú)顯著差異，進(jìn)一步兩兩比較LSD最小顯著性差異法。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 橋血管肉眼觀察

模型組橋血管在術(shù)后2 d和2周均有不同程度的管腔擴(kuò)張，管壁增厚、水腫，管腔狹窄。模型組2周后內(nèi)膜、中膜增厚最為顯著，部分血管可見(jiàn)管腔次全閉塞，壞死物沉積（圖1）。其中，與模型組比較，假手術(shù)組增生情況最輕，管腔通暢情況良好（圖2）。

圖1 模型組2周后橋血管Fig.1 Vein graft in model group（2 weeks）

圖2 假手術(shù)組2周后橋血管Fig.2 Vein graft in sham operation group（2 weeks）

2.2 HE染色

HE染色后，觀察到各組內(nèi)膜、中膜均有不同程度的增厚。通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像軟件分析，移植后2 d，模型組與假手術(shù)組比較，管腔狹窄程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；移植后2周，模型組與假手術(shù)組比較，管腔狹窄程度模型組大于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 管腔狹窄程度比較（）Tab.1 Comparison of the stenosis of lumen（）

表1 管腔狹窄程度比較（）Tab.1 Comparison of the stenosis of lumen（）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05。

2.3 各組靜脈橋或頸靜脈細(xì)胞磷酸化 p38（p-p38）免疫組化染色

在顯微鏡下觀察靜脈橋中 p-p38 蛋白表達(dá)，呈現(xiàn)粉紅色者為陽(yáng)性表達(dá)（圖3箭頭所示），無(wú)著色則為陰性表達(dá)。研究結(jié)果顯示，p-p38 蛋白在黏膜層、黏膜下層、肌層均有不同程度的表達(dá)。與假手術(shù)組相比，模型組靜脈橋組織內(nèi) p-p38 蛋白表達(dá) OD 值顯著升高（P＜0.05），模型組靜脈橋組織內(nèi) p-p38 蛋白表達(dá) OD 值在移植后2 d高于移植后2周，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖3 各組兔靜脈組織中 p-p38MAPK 表達(dá)（×20）Fig.3 p-p38 MAPK expression in vein tissues of the rabbits in each group（× 20）

圖4 各組兔靜脈組織中p-p38 MAPK表達(dá)OD值Fig.4 OD value of p-p38 MAPK expression in vein tissues of the rabbits in each group

3 討論

冠心病可引起心絞痛、心梗和缺血性心衰，是全球首位死亡原因[4]。通過(guò)移植自體血管恢復(fù)冠心病患者心肌灌注（再血管化）的冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（coronary artery bypass graft，CABG）是臨床上治療冠心病廣泛應(yīng)用的治療手段，特別對(duì)于復(fù)雜的多支病變的冠心病患者[5-6]。大隱靜脈由于長(zhǎng)度長(zhǎng)、解剖位置表淺等優(yōu)點(diǎn)成為80%的 CABG再血管化中選用的橋血管[7]。但靜脈橋再狹窄導(dǎo)致患者心絞痛再次出現(xiàn)而需要二次手術(shù)，從而嚴(yán)重制約了 CABG 的療效[8]。CABG 術(shù)后1 a，大約10%的靜脈橋完全閉塞，術(shù)后2～6 a里，每年新增1～2%的靜脈橋閉塞，術(shù)后7～10 a，每年新增靜脈橋閉塞率增至4%，手術(shù)10 a后接近 50%的靜脈橋閉塞[9-10]。因此研究靜脈橋再狹窄通路機(jī)制對(duì)未來(lái)發(fā)現(xiàn)靜脈橋再狹窄藥物治療的靶點(diǎn)具有重要的意義。

靜脈橋再狹窄，主要因?yàn)殪o脈移植到動(dòng)脈環(huán)境后發(fā)生“動(dòng)脈”粥樣硬化。正常靜脈不會(huì)發(fā)生粥樣硬化，但移植靜脈血流力學(xué)環(huán)境改變后，移植靜脈為了適應(yīng)新環(huán)境發(fā)生“動(dòng)脈化”，血管平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cell，SMC）的增殖、遷移引起內(nèi)膜增厚是后期發(fā)生粥樣硬化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[11]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）最早在細(xì)胞有絲分裂中被發(fā)現(xiàn)，是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，故而得名，該激酶磷酸化是其活化狀態(tài)。與動(dòng)脈SMC相比，靜脈SMC顯示出增強(qiáng)的 MAPK 依賴性增殖[12]。p38-MAPK 通路是 MAPK 經(jīng)典通路之一，與了細(xì)胞的增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)、遷移、侵襲、形變以及干細(xì)胞分化等過(guò)程，各種刺激，例如炎性細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子或外在作用力，都可以激活 p38-MAPK通路[13]。靜脈橋再狹窄涉及的分子機(jī)制復(fù)雜，有待進(jìn)一步闡明，已有研究結(jié)果提示 p38-MAPK 通路參與其中，Ge 等[14]發(fā)現(xiàn)p38 MAPK抑制劑 CBS3830 限制了動(dòng)脈化靜脈移植物的血管重塑。

為此，筆者進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，將兔靜脈移植到頸動(dòng)脈建立CABG兔模型，2 d、2周后取出靜脈橋，移植2 d后靜脈橋管徑?jīng)]有再狹窄，移植2周后，靜脈橋管徑出現(xiàn)再狹窄，免疫組化染色結(jié)果顯示模型組移植靜脈 p-p38 高于假手術(shù)組未移植的頸靜脈，提示 p38-MAPK 通路參與了靜脈橋再狹窄過(guò)程的生物信號(hào)傳導(dǎo)。靜脈移植2 d靜脈組織中 p-p38 高于移植2周，提示 p-p38 在移植早期明顯升高，然后逐漸回落。對(duì)CABG靜脈橋再狹窄發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的研究將為最終解決移植靜脈橋再狹窄這一臨床難題提供早期干預(yù)的靶點(diǎn)，當(dāng)然這不可能一蹴而就，還需要更多、更深入的研究。參