張景熙 馮秀敏 范韻鑫 張偉 黃怡 白沖

1海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,上海 200433;2新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院昌吉分院呼吸內(nèi)科,昌吉 831100

隨著高通量二代測序技術 (next generation sequencing,NGS)的發(fā)展,局部微生物菌群在肺部疾病中的作用日益受到關注,已有文獻報道,呼吸道及肺微生物菌群的失調(diào)可能是囊性纖維化[1-2]、哮喘[3-4]、慢性阻塞性肺疾病[5-6]、支氣管擴張[7]等多種肺疾病有關。微生物菌群與消化道、上呼吸道、生殖系統(tǒng)等腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系漸有報道,例如幽門螺桿菌感染是胃癌的主要致病因素之一[8];艾托斯坦巴 (Epstein-Bar,EB)病毒感染與Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌[9]的發(fā)生密切相關;傷寒沙門菌感染也已證實與膽囊癌的發(fā)生確切相關[10];產(chǎn)基因毒素大腸桿菌 (E.coli)、產(chǎn)腸毒素脆弱類桿 菌 (Enterotoxigenic Bacteroides fragilis,ETBF)和核梭桿菌被認為可促進結直腸癌(colorectal cancer,CRC)的發(fā)展[11]。有關肺癌患者下呼吸道微生物菌群的特征及其在肺癌發(fā)病中的作用研究較少[12]。支氣管及肺泡腔為非無菌的對外開放結構,是多種微生物重要的棲息環(huán)境。尤其當肺癌患者影像表現(xiàn)為肺炎型改變時,下呼吸道的微生物檢測通常是進行鑒別診斷的必不可少的項目之一,而此類患者支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中微生物菌群的研究尚未見報道。本研究利用高通量二代測序平臺對初診為肺炎型肺癌患者的BALF 微生物群落結構進行研究,通過與初診結節(jié)型早期肺癌患者及健康者對比,探討并分析了肺炎型肺癌患者下呼吸道微生物菌群差異特征及其臨床意義,現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 回顧性研究。納入海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科2018 年2 至2019年4月收治的病理學檢查確診的初診肺癌患者20例,男14例、女6例,年齡47～76歲,平均(64.50±7.44)歲。其中肺炎型肺癌(肺炎型)組患者9 例,男6 例,女3 例,年齡56～75 歲,平均年齡 (65.33±7.50)歲,有吸煙史者6 例(66.7%)吸煙指數(shù) (25.83±5.85)包/年,其中腺癌8例、小細胞肺癌1例;結節(jié)型肺癌(結節(jié)型組)患者11 例,男8 例,女3 例,年齡47～76歲,平均年齡 (61.64±7.46)歲,有吸煙史者7例(63.6%),吸煙指數(shù) (23.57±8.02)包/年,其中腺癌7例、鱗癌2例、小細胞肺癌1例、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤1例。

1.2 選擇標準 納入標準:(1)根據(jù)組織病理學確認的初診肺癌患者;(2)肺炎型肺癌:患者胸部CT 影像學表現(xiàn)為大片狀或多發(fā)斑片狀浸潤影且病灶最大徑>3 cm、類似于肺炎,除外感染性疾病及阻塞性肺炎,并基于2011年IASLC/ATS/ERS肺腺癌國際多學科新標準組織學明確診斷的肺癌患者[13],肺癌臨床分期依國際抗癌聯(lián)盟 (Union for International Cancer Control,UICC)第七版肺癌TNM 分期標準[14]臨床分期為不能接受手術或放療的Ⅲ期患者以及Ⅳ期患者。(3)結節(jié)型肺癌:肺部病灶最大徑≤3 cm 且TNM 分期中T1期且無淋巴結及遠處轉移患者。(4)無活動性肺部感染疾病。排除標準:(1)接受過抗腫瘤治療,包括放化療及手術治療;(2)系統(tǒng)性疾病及先天性疾病(如糖尿病、肝炎);(3)3個月內(nèi)抗生素使用史,2周內(nèi)局部抗菌治療史;(4)妊娠期或哺乳期婦女。隨機收集7例健康者作為對照組,年齡30～53歲,平均(42.00±10.66)歲,男4例,女3例,有吸煙史者1例(14.3%)吸煙指數(shù)為20包/年。本研究經(jīng)海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(CHEC2019-061),本研究符合 《赫爾辛基宣言》的原則,所有對象對本研究知情同意并簽署知情同意書。3組間性別差異無統(tǒng)計學意義,結節(jié)型組和肺炎型組均較對照組年齡大(P<0.05),結節(jié)型組與肺炎型組吸煙指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

1.3 BALF標本采集 肺炎型肺癌組及結節(jié)型肺癌患者在行CT 引導下肺穿刺前或手術等有創(chuàng)操作前按照常規(guī)術前準備在我院行支氣管鏡檢查。所有患者之前未曾行支氣管鏡檢查。受試者取平臥位,用鹽酸利多卡因霧化麻醉及丙泊酚靜脈麻醉,經(jīng)鼻進境,支氣管鏡到達主要病灶所在葉段時,即開始行支氣管肺泡灌洗操作,灌洗完畢后再根據(jù)患者病情行刷檢或活檢等后續(xù)操作。選取病灶所在肺葉作為灌洗部位以獲取BALF,注入生理鹽水100 ml,以小于-100 mm Hg(1 mm Hg=0.133 k Pa)負壓吸引回收灌洗液20 ml后立即取出5 ml放入NGS測序專用EP 管、封口膜封閉管口,-20 ℃冷凍保存通過冰袋冷鏈轉運至實驗室行下一步的核酸提取和測序分析。健康者選取右中葉支氣管進行灌洗。樣本留存及取樣保存均由培訓過的專一人員完成,并在2 h內(nèi)送檢。

1.4 DNA 測序 取600μl患者的BALF,玻璃珠混合震蕩后按照 TIANamp Micro DNA Kit(DP316,TIANGEN BIOTECH,Beijing,China)試劑盒步驟提取DNA。提取后的DNA 超聲破碎至200～300 bp大小的片段。采用高通量測序儀器BGISEQ-50/MGISEQ-2000-機器型號行文庫構建和測序,使用Agilent 2100 Bioanalyzer質控文庫插入片段大小,使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher Scientific Inc.)質控DNA 文庫濃度,經(jīng)環(huán)化形成単鏈環(huán)形結構。環(huán)化后的文庫經(jīng)滾環(huán)復制 (Rolling circle amplification,RCA)生成DNA 納米球(DNA Nanoballs,DNB)。制備好的DNB納米球加載到測序芯片,使用BGISEQ-50進行測序[2]。

1.5 數(shù)據(jù)分析 測序數(shù)據(jù)下機后去除低質量的和長度<35 bp 的數(shù)據(jù)以獲得高質量的數(shù)據(jù)。通過BWA (BWA:http://bio-bwa.sourceforge.net/)比對將高質量數(shù)據(jù)中比對上人參考基因組序列的數(shù)據(jù)去除[3]。剩下的數(shù)據(jù)在去除低復雜度reads后與專用 細 菌 (3 446種)、真 菌 (206 種)、病 毒(4 152種)、寄生蟲 (140種)4個微生物大數(shù)據(jù)庫比對,獲得能夠匹配到某種病原體的序列數(shù)。將BALF中序列數(shù)排名前三的細菌菌種定義為優(yōu)勢細菌。

表1 3組性別、年齡和吸煙指數(shù)比較

1.6 統(tǒng)計學分析 采用Graphpad Prism 5統(tǒng)計軟件及SigmaPlot 12.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布計量資料以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析、組內(nèi)兩兩比較采用Bonferroni法,兩組樣本均數(shù)的比較采用t檢驗,計數(shù)資料采用例數(shù) (%)表示,組間比較采用χ2檢驗, 非正態(tài)分布計量資料采用中位數(shù)[M(P25,P75)]表達,組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗,采用ROC 曲線檢測肺炎型肺癌診斷預測價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺炎型肺癌、結節(jié)型肺癌患者及對照組BALF中細菌總序列、菌屬種類、菌種數(shù)量比較肺炎型組患者BALF 中檢出細菌中位序列數(shù)量為9 235 (3 498,30 743),高于對照組 [382 (98,2 508)]及結節(jié)型組 [486 (96,780)],差異有體統(tǒng)計學意義(P=0.001及0.001),結節(jié)型組與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義 (P=0.810)。肺炎型組患者檢出中位細菌菌屬種類為5 (4.5,8.5)]種,較對照組 [4 (2,5)]及結節(jié)型組[2 (2,7)]菌屬屬種有增多趨勢,但組間比較差異無統(tǒng)計學意義;肺炎型組患者檢出中位細菌菌種種類分別為[9 (6.5,10.5)]種,肺炎型組較對照組[2 (2,6)]及結節(jié)型組[4 (2,7)]細菌菌種增多,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.015及P=0.021)。見表2。

2.2 3組BALF中細菌菌屬分布比較 27例受試者BALF中共檢出29種細菌屬,從高到低依次排列為鏈球菌屬16例 (59.3%)、普雷沃菌屬14例(51.9%)、丙酸桿菌屬9例 (33.3%)、韋榮球菌屬7例(25.9%)、奈瑟菌屬7例(25.9%)、葡萄球 菌 屬7 例 (25.9%)、 嗜 血 桿 菌 屬6 例(22.2%)、假單胞菌屬4例(14.8%)、梭桿菌屬、二氧化碳噬纖維菌屬、放線菌屬、棒狀桿菌屬各3例(11.1%)、擬普雷沃屬、顆粒鏈球菌屬、孿生球菌屬、不動桿菌屬、彎曲菌屬、埃希菌屬、纏結真桿菌屬、羅氏菌屬、牙齦溝產(chǎn)線菌屬、口腔纖毛菌屬各2例(7.4%)、結核分枝桿菌復合群、乳桿菌屬、擬桿菌屬、消化鏈球菌屬、莫拉菌屬、博得特菌屬、營養(yǎng)缺陷菌屬各1例。對檢出4個菌屬以上的患者占比進行了組間比較,結果顯示:肺炎型組和結節(jié)型組鏈球菌屬和普雷沃菌屬檢出率均高于對照組,肺炎型組韋榮球菌屬檢出率高于結節(jié)型組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

2.3 3組BALF 中優(yōu)勢菌菌屬序列比較 對肺炎型組患者BALF 中鏈球菌屬、普雷沃菌屬、丙酸桿菌屬、韋榮球菌屬、奈瑟菌屬、葡萄球菌屬、嗜血桿菌屬及假單胞菌屬的序列數(shù)占細菌總序列數(shù)百分比與對照組及結節(jié)組進行比較,結果顯示肺炎型組及結節(jié)型組BALF 中丙酸桿菌屬 [1.5%(0.1～2.8)、6.0% (3.7～8.6)]所占百分均比低于對照組59.6% (23.4～88.8),肺炎組較對照組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.030),見表4。

2.4 3 組BALF 中細菌菌種分布比較 對27 例受試者BALF中細菌進行分析,檢出產(chǎn)黑普雷沃菌12 例、痤瘡丙酸桿菌6 例、小韋榮球菌5 例、灰黃色普雷沃菌3例、表皮葡萄球菌3例、口腔鏈球菌3例、肺副血鏈球菌2例、肺炎鏈球菌2例、殊異韋榮球菌2例、坦納擬普雷沃菌2例、大腸埃希菌2例、放線菌2例、奧斯陸莫拉菌、產(chǎn)氣腸桿菌、檸檬酸桿菌、溶血孿生菌、牙齦二氧化碳噬纖維菌、顆粒二氧化碳噬纖維菌、假肺炎鏈球菌、嬰兒鏈球菌、施氏假單胞菌、綠針假單胞菌、非典韋榮球菌、副流感嗜血桿菌各1例。對在三組中均可檢出的菌種占比進行比較,發(fā)現(xiàn)肺炎型組中產(chǎn)黑普雷沃菌陽性患者8例(8/9,88.9%),較結節(jié)型組3 例 (3/11,27.3%) 及 對 照 組1 例 (1/7,14.3%)陽性率增高,差異有統(tǒng)計學意義 (均P=0.01);肺炎型組產(chǎn)黑普雷沃菌序列數(shù)為2 392(521.3,11 715)高于對照組 [219 (219)]及結節(jié)型組[48 (9,498)],與結節(jié)型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0485)。肺炎型組小韋榮球菌優(yōu)勢患者2例、結節(jié)型組1例、對照組2例;肺炎型組痤瘡丙酸桿菌陽性患者1例、結節(jié)型組1例、對照組4 例,組間差異無統(tǒng)計學意義 (P=0.190)。

表2 3組BALF中細菌總序列數(shù)、細菌菌屬種類、菌種種類比較 [M(P 25,P 75)]

表3 3組BALF中優(yōu)勢菌屬分布比較 [例 (%)]

表4 3組BALF中優(yōu)勢菌數(shù)細菌屬序列比較 [M(P 25,P 75)]

2.5 BALF中細菌序列數(shù)、菌屬及菌種與結節(jié)型肺癌大小相關性分析 結節(jié)型肺癌患者肺癌可測量結節(jié)平均最大徑為 (1.57±0.78)cm,與患者BALF中細菌序列數(shù)呈弱正相關,相關系數(shù)呈統(tǒng)計學意義(r2=0.418,P=0.031),與細菌屬的種類及菌種種類無相關性(P=0.059及0.083),見表5。

2.6 BALF 中細菌序列數(shù)預測肺炎型肺癌的價值 根據(jù)普雷沃菌屬序列數(shù)占比為37.29%為臨界值,預測肺炎型肺癌診斷的敏感性為88.89%(95%CI:0.517 5～0.997 2),特異性88.89%(95%CI:0.652 9～0.986 2),曲線下面積為0.84 (0.663～1.000),P=0.004 7;根據(jù)產(chǎn)黑普雷沃菌序列數(shù)263為臨界值,預測肺炎型肺癌診斷的敏感度為88.89% (95%CI:0.517 5 ～0.997 2),特異度94.44% (95%CI:0.727 1～0.998 6),曲線下面積為0.92 (0.785～1.000),P=0.000 47),見表6,圖1。

圖1 普雷沃菌屬及產(chǎn)黑普雷沃菌為標記物預測肺炎型肺癌診斷的ROC曲線

表5 BALF中細菌序列數(shù)、菌屬及菌種與結節(jié)型肺癌大小相關性分析

表6 BALF中普雷沃菌屬序列和產(chǎn)黑普雷沃菌序列數(shù)預測肺炎型肺癌診斷價值

3 討論

已有文獻證實微生物菌群與各類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,從微生物組學探討對肺癌發(fā)病、診斷或治療的影響成為肺癌研究的熱點之一。有關下呼吸道菌群與肺癌的關系研究相對較少,本研究選擇了臨床上類似肺炎表現(xiàn)的肺癌患者為研究對象,采用高通量二代測序技術 (NGS)對患者BALF 中細菌DNA 的16S r RNA 進行測序,首次探討了肺炎型肺癌患者下呼吸道局部微生物菌群的特征,并與結節(jié)型早期肺癌及健康者進行了對比,對更全面地認識不同類型肺癌微生物學特征提供了臨床參考。作為研究微生物組學的新方法,NGS技術不僅可以快速鑒定出尚不能人工培養(yǎng)的微生物,也可以對樣本中含量較低的種屬進行準確測序,并具有樣本需要量小、速度快、覆蓋度高等優(yōu)點,在精準醫(yī)學發(fā)展中具有重要作用。NGS 技術檢測發(fā)現(xiàn),肺炎型肺癌患者下呼吸道細菌數(shù)量明顯增多,細菌菌屬及菌種均較對照組及結節(jié)型組增多,提示肺炎型肺癌患者局部細菌呈多樣性改變,微生物環(huán)境更為復雜。某些細菌數(shù)量的增多或減少與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。已有研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者痰液或BALF標本中普雷沃菌屬、鏈球菌屬、韋榮球菌屬豐度表達增高[15-16]。Huang等[16]發(fā)現(xiàn)普雷沃菌屬在肺癌患者BALF 中占主要成分,其后依次為鏈球菌屬、韋榮球菌屬及奈瑟菌屬,存在遠處轉移腺癌患者BALF 中鏈球菌屬豐度低于無遠處轉移患者,有遠處轉移的鱗癌患者中韋榮球菌屬顯著高于未轉移者,Lee等發(fā)現(xiàn)韋榮球菌屬在肺癌患者下呼吸道含量明顯增高[17]。既往研究未重點突出呈肺炎型改變的局部晚期肺癌的微生物學特征,本研究則重點比較了這一局部晚期特殊類型肺癌患者的微生物學特征,有研究發(fā)現(xiàn)鏈球菌屬、普雷沃菌屬、韋榮球菌屬、假單胞菌屬及二氧化碳噬纖維菌屬陽性率顯著高于對照組,與既往肺癌研究結果類似,同時發(fā)現(xiàn)丙酸桿菌、葡萄球菌、棒狀桿菌較健康對照組有降低趨勢,下呼吸道菌群的差異化表達再次證實與肺癌的發(fā)生發(fā)展存在一定關系。當然,還需要進一步擴大樣本深入研究。微生物菌群存在著促癌作用或抑癌作用是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的潛在機制之一?？谇击[癌患者唾液中鏈球菌屬、牙齦卟啉單胞菌屬、厭氧菌嗜二氧化碳噬細胞菌豐度被證實參與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展[18],普雷沃菌及鏈球菌數(shù)量增多則與食道癌淋巴結轉移及不良預后有關[19],提示上述細菌均具有一定促癌作用。丙酸桿菌、棒狀桿菌、乳酸桿菌及雙歧桿菌等桿菌屬則可通過誘導非特異性免疫激活途徑抑制腫瘤細胞生長而發(fā)揮抗腫瘤作用[20-22]。本研究結果證實肺炎型肺癌患者下呼吸道促癌菌群無論種類及數(shù)量上均顯著增高,而抑癌菌群含量下降,抑癌/促癌細菌的比例失調(diào)特征明顯。促癌細菌通過多種機制參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。已有文獻證實口腔微生物菌屬在口腔腫瘤、肺癌、食道癌、結直腸癌、胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[23],肺炎型肺癌高表達的菌屬多屬于口腔常見微生物菌屬。其中普雷沃菌可促進細胞分泌揮發(fā)性硫化合物例如硫化氫、甲硫醇、二甲基硫醚、二甲基二硫化物等致癌物質[24],導致基因組不穩(wěn)定或累積突變、并可激活增殖、遷移和侵襲性信號通路影響腫瘤的生長和擴散、抑制腫瘤細胞凋亡、增強腫瘤血管生成[25,26]。鏈球菌屬通過TLR2受體上調(diào)IL-6表達,增加肺腺癌細胞黏附活性促進肝轉移發(fā)生[27]。韋榮球菌屬激活腫瘤PI3K 信號通路促進鱗癌細胞生長[28]。Tsay等[29]發(fā)現(xiàn)普雷沃菌、鏈球菌及韋榮球菌可通過激活肺癌細胞PI3K 、ERK1/2 和VEGF 信號通路,誘導IL-1β、IL-18、IL-6等炎性介質表達,并招募炎性細胞形成局部慢性炎癥,促進腫瘤進展。作為口腔專性厭氧菌,普雷沃菌屬、韋榮球菌、奈瑟菌屬等含量增高可能與肺癌局部微環(huán)境常呈低氧狀態(tài)[30],且病灶越廣泛缺氧環(huán)境越明顯更適宜厭氧菌生長及繁殖有關。在腫瘤的進展過程中厭氧菌的繁殖增加可促進腫瘤生長,腫瘤又為細菌生長創(chuàng)造出有利環(huán)境,盡管尚無法確定兩者因果關系,但推測存在兩者交互作用、互相影響的惡性循環(huán)。本研究選取的結節(jié)型肺癌患者為T1期局部早期患者,其下呼吸道細菌種類數(shù)量未見明顯增加,但已出現(xiàn)了部分促癌菌屬,普雷沃菌屬的占比增多,細菌菌群向肺炎型肺癌促癌菌屬的分布趨勢漂移。結節(jié)型患者腫瘤直徑大小與局部細菌序列數(shù)成正比,提示隨著局部病灶的增大,細菌負荷量逐漸增加,兩組存在一定相互促進作用,及時調(diào)節(jié)干預有可能能夠抑制局部病灶的進展。近來提出的腫瘤微生物治療理論認為通過上調(diào)抑癌細菌或下調(diào)促癌細菌等手段有助于調(diào)節(jié)局部微生物菌群失調(diào),具有改善局部免疫、降低肺部炎癥、提高化療、放療及免疫治療療效等作用,將日漸成為腫瘤治療的一個重要環(huán)節(jié)[31],本研究結果為今后開展肺癌微生物治療的方向及靶點提供了部分線索。肺炎型肺癌患者影像學上呈類似肺炎表現(xiàn),臨床上很容易被誤診為肺部感染而長期使用抗生素、甚至激素,而導致較長時間的誤診、漏診,而支氣管鏡肺泡灌洗通常是最常見也是最重要的進行鑒別診斷的手段,BALF的實驗室檢查對鑒別診斷至關重要。通常肺炎型肺癌患者灌洗液中癌細胞脫落細胞陽性率不高,金標準診斷仍需要組織病理證實,但經(jīng)穿刺取組織有創(chuàng)操作通常在支氣管鏡操作后且等待病理報告時間較長,臨床上也存在部分患者病情重無法配合穿刺等操作而無法獲取病理組織等情況,微生物NGS二代測序結果報告較快,可在獲得病理結果前為臨床醫(yī)師提供一定提示及診斷傾向,本研究結果顯示,普雷沃菌屬及產(chǎn)黑普雷沃菌的含量增多具有較強的肺癌提示性,ROC曲線證實隨著該菌屬菌種數(shù)量的增加,對肺炎型肺癌診斷的特異性進一步增高,提示該菌群的高豐度表達在肺部腫瘤診斷中具有一定的潛在應用價值。但仍需要擴大樣本進一步驗證,臨床上若發(fā)現(xiàn)BALF 中此類菌群明顯增多的患者需要警惕肺部腫瘤的可能。由于肺炎型肺癌患者比例低,人數(shù)較少,留永健等[32]北京協(xié)和醫(yī)院團隊收集2013～2018年病例46例,約平均每年5例,本研究中心與之發(fā)現(xiàn)的病例數(shù)相似,為擴大樣本量檢測分析帶來了一定難度,期待今后能夠開展多中心研究加以解決。綜上所述,本文初步研究了肺炎型肺癌患者下呼吸道微生物菌群的基本組成和種群差異,發(fā)現(xiàn)肺炎型肺癌患者下呼吸道微生物菌屬菌種數(shù)量均較健康人復雜,其中以普雷沃菌屬及產(chǎn)黑普雷沃細菌分布最為普遍,占明顯優(yōu)勢,普雷沃菌屬占比及產(chǎn)黑普雷沃細菌序列數(shù)對肺炎型肺癌診斷具有一定的預測價值。及時檢查肺部彌漫性病變患者下呼吸道標本進行高通量二代測序將有助于臨床鑒別診斷,并為今后深入探討肺炎型肺癌相關發(fā)病機制及干預策略提供依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突