阮華玲，郭昆全，楊 坤，葉林秀，閻勁松，周麗榮

隨著人們生活方式及飲食習(xí)慣的改變，糖尿病發(fā)生率逐年升高[1]。糖尿病腎病(DN)是糖尿病慢性并發(fā)癥中較為常見(jiàn)的一種，早期表現(xiàn)為腎臟肥大、腎小球基底膜增厚并伴隨以腎小球系膜區(qū)為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積聚，隨著病情惡化會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化，引起腎衰竭[2-3]。目前DN的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，但脂代謝異常作為DN發(fā)生、發(fā)展的主要影響因素，逐漸成為研究的熱點(diǎn)[4]。非諾貝特作為過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPAR-α)的特異性激動(dòng)劑，是一種以降低三酰甘油(TG)為主療效的降血脂藥物[5]。既往研究表明，非諾貝特對(duì)于DN模型大鼠的腎功能具有一定保護(hù)作用[6]，但具體機(jī)制尚不清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是DN發(fā)病的核心因子，能夠與多種信號(hào)通路作用，來(lái)調(diào)控DN纖維化進(jìn)程[7]，其中TGF-β1/Smads信號(hào)通路在誘導(dǎo)ECM產(chǎn)生的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[8]。本研究通過(guò)高糖高脂飼料飼養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射構(gòu)建DN大鼠模型，利用非諾貝特干預(yù)探討其保護(hù)DN大鼠腎功能的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只4周齡SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)于廣東省南方醫(yī)科大學(xué)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2016-0041，SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境常規(guī)飼養(yǎng)，全天自由飲水。

1.2主要試劑 STZ、非諾貝特購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；高糖高脂飼料購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司；兔抗大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)、金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)、TGF-β1、Smad3、p-Smad3、Smad7、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3動(dòng)物模型制備、干預(yù)及分組 將30只大鼠分為正常對(duì)照組、模型組和非諾貝特組，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，正常對(duì)照組大鼠給予常規(guī)飼料飼養(yǎng)，模型組和非諾貝特組大鼠給予高糖高脂飼料飼養(yǎng)。飼養(yǎng)5周后，模型組和非諾貝特組大鼠單側(cè)腹腔注射30 mg/kg STZ構(gòu)建糖尿病模型[9]；72 h后檢測(cè)空腹血糖(FBG)，以FBG≥16.7 mmol/L視為造模成功，繼續(xù)飼養(yǎng)2周，檢測(cè)尿量及24 h尿蛋白定量高于造模前2倍即為DN造模成功。非諾貝特組大鼠給予50 mg/kg非諾貝特腹腔注射，正常對(duì)照組和模型組大鼠給予等量生理鹽水腹腔注射。連續(xù)干預(yù)8周，實(shí)驗(yàn)期間每周檢測(cè)1次FBG、每2周檢測(cè)1次24 h尿蛋白定量。

1.4樣本采集及處理 末次給藥后，留取24 h尿標(biāo)本，離心后取上清保存；測(cè)量各組大鼠體質(zhì)量，10%水合氯醛麻醉后，取心臟血，離心后取上清保存；利用生理鹽水灌注后迅速取出腎臟，剝離包膜稱(chēng)取腎重，并計(jì)算腎臟指數(shù)(KI)，KI=腎質(zhì)量/體質(zhì)量×1000；取部分腎皮質(zhì)，用4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋切片，剩余腎組織液氮冰凍后于-80℃環(huán)境中保存待測(cè)。

1.5生化指標(biāo)檢測(cè) 取“1.4”中留取的尿標(biāo)本和血清標(biāo)本，利用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)24 h尿蛋白定量，應(yīng)用DCX800型全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)BECKMAN公司)檢測(cè)血尿肌酐水平，并計(jì)算肌酐清除率(Ccr)，Ccr=[尿肌酐×尿液體積/血肌酐]×[1/1440][9]；應(yīng)用DCX800型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清樣本中TG、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。

1.6HE和Masson染色觀察腎組織病理特點(diǎn)及纖維化程度 取“1.4”中制備好的切片，常規(guī)脫蠟脫水后行HE染色，Olympus光學(xué)顯微鏡觀察腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，并在每個(gè)組織上隨機(jī)選取至少10個(gè)視野，利用Image-pro plus軟件計(jì)算腎小球面積(GA)；另取石蠟切片脫蠟后行Masson染色，肌纖維呈紅色、膠纖維呈藍(lán)色，藍(lán)色面積越大表示腎組織纖維化程度越嚴(yán)重。

1.7Western blot法檢測(cè)腎組織蛋白表達(dá) 取“1.4”中凍存的腎組織，液氮中研磨成粉，加入組織裂解液后提取組織總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，待溴酚藍(lán)快到膠底部時(shí)停止轉(zhuǎn)膜，4℃下用5%的脫脂奶粉封閉處理2 h，加入α-SMA(1︰500)、PAI-1(1︰500)、TIMP-1(1︰500)、TGF-β1(1︰1000)、Smad3(1︰1000)、p-Smad3(1︰1000)、Smad7(1︰1000)、β-actin(1︰1000)孵育過(guò)夜；洗膜，加入二抗(1︰200)在37℃條件下恒溫孵育1 h后，TBST漂洗40 min，使用ECL試劑盒在DNR BioImaging System上觀察膜上蛋白條帶，收集影像，采用Image J軟件測(cè)定各組條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠腎組織病理及纖維化程度 HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常，無(wú)異常病理改變；模型組大鼠可見(jiàn)腎組織間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管狹窄、萎縮，近曲小管上皮細(xì)胞壞死，腎小管擴(kuò)張，可見(jiàn)管型；非諾貝特組大鼠較模型組大鼠病變程度減輕，近曲小管好似較少，腎小管結(jié)構(gòu)恢復(fù)較好，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。Masson染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠無(wú)明顯纖維化改變；模型組大鼠腎組織纖維化程度較為嚴(yán)重，出現(xiàn)腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化改變；非諾貝特組大鼠較模型組大鼠腎組織纖維化程度減輕。見(jiàn)圖1。模型組和非諾貝特組大鼠KI、GA、纖維化程度均明顯高于正常對(duì)照組大鼠，非諾貝特組大鼠KI、GA、纖維化程度顯著低于模型組大鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠KI、GA、纖維化程度比較

圖1 各組大鼠腎組織病理改變及纖維化程度觀察(×400)

2.2各組大鼠血尿生化指標(biāo)比較 模型組大鼠24 h尿蛋白定量、TG、TC、LDL-C顯著高于正常對(duì)照組，Ccr、HDL-C水平低于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組大鼠相比，非諾貝特組大鼠24 h尿蛋白定量、TG、TC、LDL-C均顯著降低，Ccr、HDL-C水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血尿生化指標(biāo)比較

2.3各組大鼠腎組織中α-SMA、PAI-1、TIMP-1蛋白表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠腎組織中α-SMA、PAI-1、TIMP-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組大鼠相比，非諾貝特組大鼠腎組織中α-SMA、PAI-1、TIMP-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表3。

表3 各組大鼠腎組織中α-SMA、PAI-1、

圖2 各組大鼠腎組織中α-SMA、PAI-1、TIMP-1蛋白表達(dá)圖譜 α-SMA為α-平滑肌肌動(dòng)蛋白，PAI-1為纖溶酶原激活物抑制劑-1，TIMP-1為金屬蛋白酶組織抑制劑-1

2.4各組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠腎組織中TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表達(dá)水平顯著升高，Smad7蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組大鼠相比，非諾貝特組大鼠腎組織中TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表達(dá)水平顯著降低，Smad7蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表4。

圖3 各組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)圖譜 TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

表4 各組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

DN為一種糖尿病慢性并發(fā)癥，終末期腎衰竭是引起糖尿病患者死亡的主要原因。隨著糖尿病發(fā)生率逐年升高，DN的發(fā)生率也逐年升高。蛋白尿是DN患者主要的臨床特征，而尿蛋白排泄量的增加提示患者腎功能受損，也是目前臨床上診斷DN最主要的生化指標(biāo)[10]。本研究利用高糖高脂飼料飼養(yǎng)聯(lián)合STZ腹腔注射制備糖尿病大鼠模型[11]，造模后通過(guò)檢測(cè)24 h尿蛋白定量增加情況來(lái)構(gòu)建DN模型。研究表明，富含小顆粒的TG及致密LDL氧化、糖化后的脂蛋白具有細(xì)胞毒性，通過(guò)激活體內(nèi)TGF-β1的釋放，既能激活炎癥反應(yīng)，引起腎組織炎性浸潤(rùn)，又能促進(jìn)ECM的生成，引起腎臟肥大及ECM進(jìn)行性積累，造成腎小球硬化[12]。PPAR-α是由配體激活的一類(lèi)核轉(zhuǎn)錄因子，在肝臟中廣泛表達(dá)，參與脂肪調(diào)控過(guò)程。非諾貝特是一種PPAR-α激動(dòng)劑，主要通過(guò)激活PPAR-α從而發(fā)揮降脂作用[13-16]。除了具有降脂作用外，非諾貝特還具有抗氧化、抗癌、抗炎及抗凋亡等多種生物學(xué)活性[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠腎小球結(jié)構(gòu)損傷明顯改善，且24 h尿蛋白定量顯著降低，Ccr明顯升高，可能是因?yàn)榉侵Z貝特發(fā)揮降脂作用，降低了TG、LDL-C水平，減少了損傷細(xì)胞的脂蛋白生成，同時(shí)還能發(fā)揮抗炎作用減輕腎組織中炎性浸潤(rùn)，從而減輕了對(duì)腎組織細(xì)胞的損傷。

腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化是DN腎衰竭主要的病理改變。高血糖、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等因素均是DN患者腎纖維化的危險(xiǎn)因素。ECM的過(guò)量積累是引起腎纖維化的主要原因，而腎小管中的ECM主要由成纖維細(xì)胞合成，α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的主要靶標(biāo)蛋白，其表達(dá)水平升高提示ECM分泌功能增強(qiáng)[19]。PAI-1和TIMP-1受TGF-β1信號(hào)調(diào)控，前者通過(guò)抑制纖溶酶原激活物激活減少膠原及糖蛋白的降解[20]，而后者則是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的主要抑制劑，能夠通過(guò)降低MMPs的合成來(lái)減少ECM的降解[21]，二者表達(dá)增強(qiáng)會(huì)促進(jìn)纖維化的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織中α-SMA、PAI-1、TIMP-1蛋白表達(dá)顯著升高，非諾貝特干預(yù)后α-SMA、PAI-1、TIMP-1蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明非諾貝特能夠抑制ECM的大量生成，從而減緩腎纖維化進(jìn)程。TGF-β1/Smad3作為調(diào)控腎纖維化的主要信號(hào)通路，DN發(fā)生后誘導(dǎo)TGF-β1合成增加，TGF-β1高表達(dá)后與其Ⅱ型受體在胞外結(jié)合并使Ⅰ型受體磷酸化，激活下游的Smad2/Smad3，并與Smad4結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而誘導(dǎo)PAI-1和TIMP-1等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)升高[22]。Smad7作為一種抑制因子，能夠與TGF-β1受體結(jié)合，抑制Smad2/Smad3轉(zhuǎn)錄[23]。本研究結(jié)果顯示，DN模型大鼠腎組織中TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表達(dá)水平顯著升高，而Smad7蛋白表達(dá)水平顯著降低，非諾貝特干預(yù)后大鼠腎組織中TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表達(dá)水平顯著降低，而Smad7蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明非諾貝特能夠通過(guò)抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，降低促纖維化因子表達(dá)，從而緩解DN大鼠腎纖維化損傷。

綜上，非諾貝特可能通過(guò)降低DN大鼠血脂抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路激活，降低促纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)，改善腎纖維化進(jìn)程，從而保護(hù)腎功能。