田 杰，范芝宏, 楊 娟, 蔣雪瑩, 楊明東, 郭曉芳

登革熱(Dengue fever，DF)是由登革病毒(dengue virus, DENV)引起的急性蚊媒傳染病，主要通過埃及伊蚊或白紋伊蚊叮咬傳播。DENV有4個血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4)[1]。2019年，WHO將登革熱列為“2019年全球十大健康威脅”之一[2]。目前全球有128個國家，約39億人口處于疾病風(fēng)險之中，年感染DENV人數(shù)3.9億[3-4]。2015-2018年我國廣東、云南、浙江、福建、海南、湖南和山東省累計報告登革熱暴發(fā)111起，共涉及12 490例病例[5]。云南省位于我國西南部，邊境線4 060 km，與常年有登革熱流行的緬甸、老撾、越南接壤。僅2009-2014年，從東南亞輸入云南的登革熱病例為384例[6]。自2013年云南省首次暴發(fā)登革熱以來，瑞麗市每年均有登革熱的暴發(fā)流行[7]。而景洪市于2013年、2015年和2017年先后發(fā)生了DENV-3、DENV-2和DENV-1的暴發(fā)流行[7-9]。2013-2018年，玉溪市除了2016年，每年僅有1～3例輸入病例報告，分別來自云南西雙版納州及泰國、老撾、緬甸和馬來西亞。為弄清2019年玉溪市輸入的登革病毒血清型及病毒來源，本研究對登革熱病例樣本進行病原檢測和分析，為當(dāng)?shù)氐歉餆岱揽靥峁┎≡瓕W(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 2019年輸入玉溪市的登革熱疑似病例和臨床診斷病例的診斷依據(jù)為《登革熱診斷》WS 216-2018[10]。采用廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的膠體金法登革病毒NS1抗原檢測試劑作為病例臨床診斷試劑。血清樣本采集后冷藏運輸至本實驗室-80℃冰箱保存待檢。病例個案信息來自國家傳染病報告信息管理系統(tǒng)。

1.2方 法

1.2.1DENV RNA提取和血清型分型 吸取200 μL血清樣本，用西安天隆公司生產(chǎn)的病毒DNA/RNA提取試劑盒(磁珠法)提取病毒RNA。參考《登革熱診斷》WS 216-2018合成DENV1-4型特異引物和探針，用實時熒光RT-PCR進行DENV血清型分型。PCR試劑為ABI AgPath-IDTMOne-step RT-PCR Kit(AM1005)。PCR反應(yīng)條件設(shè)置為：50 ℃ 30 min，95 ℃ 10 min；95 ℃15 s，60 ℃ 45 s，運行40個循環(huán)，熒光信號的收集設(shè)置在每次循環(huán)的退火延伸時進行。結(jié)果判斷以Ct值<35(熒光信號數(shù)據(jù)線性化處理后對應(yīng)循環(huán)數(shù)生成的曲線圖呈“S”形的標(biāo)本)可判斷為相應(yīng)的登革病毒核酸檢測陽性。

1.2.3相似性和進化分析 用Megalign分析所得E基因序列的核苷酸相似性和氨基酸同源性。進化分析的參考序列下載自美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫，包括在NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST模塊對獲得的E基因序列進行比對后選取的相似性最高的基因序列、各血清型登革病毒的基因型代表序列和近年東南亞國家的登革病毒序列。以及本實驗室檢測獲得的2019年景洪市1-3型登革病毒E基因序列。用MEGA 7(http://www.megasoftware.net)中的ML法進行遺傳進化樹構(gòu)建，模型選用 Kimura2-parameter model。Bootstrap 值設(shè)定為1 000。

2 結(jié) 果

2.12019年輸入性登革熱病例 2019年玉溪市累計報告輸入性登革熱病例23例。4月至10月，除7月外，每月均有輸入病例報告。在4月份監(jiān)測到首例從越南芽莊輸入的登革病例，在5月、6月和10月共監(jiān)測到從柬埔寨輸入病例3例，8月監(jiān)測到從緬甸輸入病例1例，9月3日至10月24日，從云南省西雙版納州輸入18例。輸入病例主要分布在江川區(qū)(9例)和紅塔區(qū)(8例)。23例輸入病例年齡在21～56歲，年齡中位數(shù)為30歲。男性12例，女性11例。人群分類為農(nóng)民11例、家務(wù)及待業(yè)5例、工人1例、民工1例、不詳5例。

2.2DENV血清型分型和基因分型結(jié)果 從20份血清樣本(包括17份從西雙版納州景洪市輸入樣本，2份為從柬埔寨輸入樣本，1份為緬甸輸入樣本)中共檢測到18份DENV陽性，其中在17份景洪輸入樣本中檢測到11份DENV-1、5份DENV-2和1份DENV-3；在2份柬埔寨輸入樣本中檢出1份DENV-1陽性；1份緬甸輸入樣本為DENV陰性。20份樣本采血時間為發(fā)病后3～10 d。1例DENV陰性的柬埔寨輸入樣本為NS1抗原檢測陽性，為發(fā)病后第5 d采集。1例DENV陰性的緬甸輸入樣本為NS1抗原檢測陰性，為發(fā)病后第6 d采集。

2.3DENV E基因相似性與進化分析 對18份DENV血清型陽性樣本進行RT-PCR和測序，僅從17例景洪市輸入的DENV陽性樣本中得到6條DENV-1 E基因序列(1 485 bp)、3條DENV-2 E基因序列(1 485 bp)、1條DENV-3 E基因序列(1 479 bp)。

6條DENV-1 E基因序列的核苷酸相似性為99.4%～100%，氨基酸同源性為99.6%～100%。與從GenBank下載的31條參考序列、4條2019年景洪市本地流行的E基因序列進行進化分析。結(jié)果顯示，共41條序列分為5個基因型，6株DENV-1均屬于基因I型，分別位于兩個不同的進化分支(a，b)中(圖1)。a進化分支的序列由2019年流行的DENV-1組成，源自云南玉溪市(9-10月)與景洪市(9月)、廣州(10月)、江西南昌市(6月)、河南(8月)和柬埔寨(6月)。在a進化分支中，4條玉溪市E基因序列(19YX7、19YX12、19YX14、19YX15)與2019年景洪市本地流行株(JH48、JH57、JH60)和2019年廣州流行株(GenBank號：MN921432)的核苷酸相似性為100%。b進化分支的序列均為2019年流行的DENV-1，源自云南玉溪市(9-10月)與景洪市(9月)、江西南昌市(4月)、廣州(9月)和柬埔寨(4-5月)。該進化分支中2條E基因序列(19YX2、19YX13)與2019年景洪市本地流行株(JH78)、2019年從柬埔寨株(MW314720)、2019年廣州流行株(GenBank號：MN921447、MN923083)和2019年南昌株(GenBank號：MN894235)的核苷酸相似性最高為100%。

▲為2019年輸入玉溪的DENV-1 E基因序列；●為2019年景洪市本地流行的DENV-1 E基因序列

3條DENV-2 E基因序列核苷酸相似性為91.1%～99.9%，氨基酸同源性為97.4%～99.8%。與從GenBank下載的24條序列及2019年在云南景洪市本地流行的5條E基因序列進行進化分析。結(jié)果顯示，共32條序列分為5個基因型，3株DENV-2分布在亞洲Ⅰ基因型(Asian I)和全球基因型(Cosmopolitan)中，均與2019年景洪市流行株位于同一進化分支中(圖2)。1株 全球基因型(YX8)與2019年景洪市流行株(JH22)的核苷酸相似性為99.8%，氨基酸同源性為99.6%。2株AsianⅠ基因型(YX1/YX4)與2019年景洪市流行株(JH38/JH89/JH92/JH100)的核苷酸相似性為99.8%～100%，氨基酸同源性為99.8%～100%。

▲為2019年輸入玉溪的DENV-2 E基因序列；●為2019年景洪市本地流行的DENV-2 E基因序列

1條DENV-3 E基因序列(YX5)與從GenBank下載的23條序列及2019年景洪市的1條E基因序列進行進化分析。結(jié)果顯示，共25條序列分為4個基因型。YX5與2019年景洪市流行株(JH75)位于同一進化分支，屬于基因Ⅲ型(圖3)。YX5與2019年景洪市流行株(JH75)的核苷酸相似性為99.3%，氨基酸同源性為100%。

▲為2019年輸入玉溪的DENV-3 E基因序列；●為2019年景洪市本地流行的DENV-3 E基因序列

3 討 論

2019年登革熱在全球范圍內(nèi)廣泛流行，美洲和亞洲區(qū)域多個國家和地區(qū)登革熱流行強度超過2018年同期水平[11-14]。2019年7-9月在東南亞和西太平洋地區(qū)，菲律賓、馬來西亞、新加坡、越南、柬埔寨等國家是受疫情影響最為嚴(yán)重的國家[12-14]。由東南亞國家輸入的登革熱病例高于去年同期水平，國內(nèi)廣東、云南、江西和福建等省份暴發(fā)本土群聚性疫情[11,13]。

玉溪市位于滇中腹地，交通便利，存在登革熱輸入的便利條件。2019年4月至10月，玉溪市共監(jiān)測到來自西雙版納州、柬埔寨、緬甸和越南的輸入性病例23例，其中18例為9月至10月從西雙版納州輸入，無本地登革熱病例報告，與往年相比輸入病例數(shù)量和輸入來源地區(qū)/國家數(shù)量均有增加，且輸入病例來源以西雙版納為主。輸入病例以成年人為主，分布于9縣/區(qū)中的7個縣區(qū)，主要分布在江川區(qū)和紅塔區(qū)。人群分類以農(nóng)民、家務(wù)及待業(yè)為主。登革熱傳播媒介白紋伊蚊在云南呈全省性分布[15]，玉溪市屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，溫和濕潤，有利于蚊蟲孳生，2015年玉溪市在中心城區(qū)首次監(jiān)測到白紋伊蚊且密度較高[16]，因此玉溪市存在因登革熱輸入引起本地傳播及暴發(fā)的風(fēng)險，提示今后應(yīng)在全市范圍內(nèi)進一步加強對農(nóng)民、家務(wù)及待業(yè)等人群的登革熱防控知識宣傳和病例監(jiān)測工作。

對輸入病例進行病原檢測和E基因進化分析發(fā)現(xiàn)，2019年從景洪市輸入的病例中檢測到3個血清型的登革病毒(DENV-1/DENV-2/DENV-3),其中6株DENV-1屬于基因I型，3株DENV-2屬于兩個基因型(Asian I基因型和Cosmopolitan 基因型)，1株DENV-3屬于基因Ⅲ型。溯源分析發(fā)現(xiàn)，輸入的DENV-1 E基因序列均與2019年景洪市本地流行株E基因序列相似性為100%，與病例的流行病學(xué)史相符。同時，與2019年從柬埔寨輸入云南的病毒株、2019年廣州和江西南昌流行株進化關(guān)系較近。輸入的3株DENV-2 分別屬于Asian I基因型和Cosmopolitan 基因型，均與2019年景洪市DENV-2本地流行株位于同一進化分支，核苷酸相似性最高，與病例流行病學(xué)史相符。其中Asian I基因型序列與東南亞國家流行株進化關(guān)系較近，位于同一大的進化分支中。Cosmopolitan 基因型的序列與2017-2019年廣州、泰國流行株進化關(guān)系較近。輸入的1株DENV-3 E基因序列屬于基因III型，與2019年景洪市流行株的核苷酸相似性最高為99.3%，氨基酸同源性為100%，與病例流行病學(xué)史相符。同時，與2019年緬甸流行株進化關(guān)系較近，位于同一進化分支。

綜上所述，2019年玉溪市輸入性登革熱病例中存在境外輸入和本省其它地區(qū)輸入兩種類型登革病例，輸入型病例攜帶3種登革病毒(登革病毒1、2和3型)，病毒分子遺傳進化分析結(jié)果提示輸入性登革病毒與東南亞國家流行的登革病毒毒株進化關(guān)系最近，提示需進一步加強登革熱境內(nèi)外輸入病例的檢測和監(jiān)測，同時加強登革熱防控知識宣傳工作。

利益沖突：無