杜洪， 夏英， 金泳， 韋四喜,， 夏萬(wàn)松， 李紅羽， 袁婷， 黃海*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心， 貴州 貴陽(yáng) 550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 貴州 貴陽(yáng) 550001)

胃癌(gastric cancer, GC)是全球高發(fā)腫瘤之一，2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示GC發(fā)病率為5.6%、排第5位，死亡率為7.7%、排第4位[1]。我國(guó)GC發(fā)病率居亞洲首位，也是我國(guó)僅次肺癌的第2大高發(fā)腫瘤[2-4]。GC的侵襲和遷移往往伴隨著患者病情的惡化，同時(shí)也是GC患者生存率低、預(yù)后較差的主要原因之一[5-6]。因此，尋找介導(dǎo)GC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，并確定其作為新的預(yù)后生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)成為當(dāng)務(wù)之急。α肌動(dòng)蛋白4(actinin alpha 4，ACTN4)定位于人染色19q13.2，基因跨度38647649～38731589，可通過(guò)與絲狀肌動(dòng)蛋白(actin-filament，F(xiàn)-actin)相互作用從而維持細(xì)胞骨架的完整性并調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[7]。有研究報(bào)道，ACTN4與肺癌、乳腺癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8-13]，認(rèn)為ACTN4可通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而促進(jìn)GC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，有促癌作用[14]，但機(jī)制尚不清楚。因此，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析GC中ACTN4基因的表達(dá)和意義，并對(duì)ACTN4進(jìn)行GC細(xì)胞系及組織驗(yàn)證，檢測(cè)ACTN4敲低對(duì)GC細(xì)胞遷移的影響，為研究ACTN4在GC發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制提供線索，現(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞系和組織來(lái)源 GC細(xì)胞系A(chǔ)GS、MKN45、HGC-27、MGC803及正常胃黏膜細(xì)胞系GES-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，293T細(xì)胞由上海交通大學(xué)金衛(wèi)林教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。選取胃腸外科手術(shù)20例GC患者GC組織，同時(shí)取相鄰癌組織間隔5 cm以上癌旁組織作為對(duì)照；患者男13例、女7例，年齡38～85歲、平均(61.15±13.43)歲；組織標(biāo)本均有唯一識(shí)別標(biāo)記，留存于液氮中；本研究獲得醫(yī)院倫理道德委員會(huì)授權(quán)批準(zhǔn)(2020倫審第106號(hào))。

1.1.2主要試劑和儀器 UNlQ-10 柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(上海生工生物)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒和TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus,日本Takara)，聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒和高效蛋白裂解液(radio immunoprecipitation assay，RIPA；北京索萊寶)，慢病毒包裝質(zhì)粒(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院贈(zèng)予)；LightCycler480熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀(瑞士羅氏)，凝膠成像分析儀(美國(guó)BIO-RAD)，臺(tái)式冷凍離心機(jī)和普通PCR儀(美國(guó)Thermo Fisher)，倒置顯微鏡(日本NIKON)。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) GC細(xì)胞系A(chǔ)GS、MKN45、HGC-27、MGC-803及正常胃黏膜細(xì)胞系GES-1細(xì)胞系生長(zhǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，293T生長(zhǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞系置于含5%CO2、37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2生物信息學(xué)分析 亞拉巴馬大學(xué)癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)(university of alabama cancer database，UALCAN)網(wǎng)站[15]分析癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)ACTN4相關(guān)基因的差異表達(dá)，同時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)分析ACTN4與GC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期之間的相關(guān)性。

1.2.3RNA的提取及定量PCR UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞和組織總RNA，并使用Nanodrop 2000進(jìn)行定量及純度測(cè)定，所提取RNA保存于-80 ℃。cDNA第一鏈合成用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，保存于-20 ℃。TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)用于定量分析，熒光定量PCR儀反應(yīng)擴(kuò)增，以HPRT基因?yàn)閮?nèi)參，ACTN4基因擴(kuò)增引物為ACTN4-F:5′-TGGAGGTCATATCAGGGGAGC-3′，ACTN4-R:5′-GAGACCAGCTTGACGCCTTT-3′， 采用熒光定量PCR技術(shù)(real-time quantitative PCR，qRT-PCR) 檢測(cè)正常胃黏膜細(xì)胞系GES-1，GC細(xì)胞系A(chǔ)GS、MKN45、HGC-27、MGC803及20對(duì)GC組織和癌旁組織中ACTN4基因的表達(dá)量。

1.2.4ACTN4慢病毒敲低模型的構(gòu)建 將公司合成的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)質(zhì)粒、慢病毒包裝質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增。準(zhǔn)備293T細(xì)胞，包病毒前1天更換新鮮無(wú)雙抗的培養(yǎng)基，配制轉(zhuǎn)染體系：opti-MEM 1.2 mL中加目的基因的質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒摩爾比為1 ∶1，psPAS2 ∶Pmd2.G ∶shRNA plasmid為2(10 μg) ∶1(5 μg) ∶2(10 μg)制備質(zhì)?；旌弦?，opti 1.2 mL中按1 ∶6 的比例加PEI 150 μL，靜置20 min。將上述混合液加無(wú)抗培養(yǎng)基5 mL，6～8 h后換液，加培養(yǎng)基10 mL；于轉(zhuǎn)染24、36、48及72 h各收1次病毒，0.45 μm濾頭過(guò)濾；GC AGS細(xì)胞鋪6孔板密度為60%～80%，設(shè)置非感染組和感染組，非感染組細(xì)胞加polybrene 2 μL、感染組細(xì)胞加病毒和polybrene 2 μL，24 h換液，細(xì)胞篩選、培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)基，36 h加嘌呤霉素篩選；非感染組細(xì)胞全部被嘌呤霉素殺死則判斷慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn) 先用marker筆于6孔板背后做好標(biāo)記，細(xì)胞按5×105個(gè)/孔接種使其均勻分布，5%CO2、37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后用10 μL槍頭垂直于直尺，于6孔板孔內(nèi)劃2條垂直相交劃痕；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗細(xì)胞3次，去除懸浮細(xì)胞，加入含有1%血清培養(yǎng)基；置于5%CO2、37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于0、24及36 h采用倒置顯微鏡觀察、拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析

課題組前期通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ACTN4在GC中高表達(dá)，ACTN4高表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期相關(guān)；同時(shí)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示ACTN4增高提示患者預(yù)后不良(P<0.05)，綜合分析提示在GC中腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期與ACTN4表達(dá)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 ACTN4 mRNA和蛋白的表達(dá)

結(jié)果顯示，AGS細(xì)胞系中ACTN4 mRNA的表達(dá)量明顯高于GES-1細(xì)胞系，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與GES-1細(xì)胞系相比，AGS細(xì)胞系中ACTN4蛋白表達(dá)量上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，20例GC組織中ACTN4 mRNA表達(dá)量較癌旁組織高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 敲低ACTN4后對(duì)AGS細(xì)胞遷移的影響

運(yùn)用shRNA慢病毒干擾技術(shù)構(gòu)建AGS細(xì)胞系A(chǔ)CTN4基因低表達(dá)細(xì)胞模型，Western blot檢測(cè)ACTN4蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示sh-KD1組和sh-KD2組AGS細(xì)胞ACTN4蛋白表達(dá)水平分別低于sh-NC組(P<0.05)；劃痕實(shí)驗(yàn)表明sh-KD1組和sh-KD2組AGS細(xì)胞24、36 h細(xì)胞劃痕愈合率均分別較sh-NC組降低(P<0.05或P<0.01)。

3 討論

ACTN4基因定位于染色體19q13.2，在腫瘤的轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色[16]，課題組前期通過(guò)對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果顯示，ACTN4基因在GC中高表達(dá)。數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示ACTN4基因高表達(dá)與腫瘤組織的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，顯示其與GC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，生物信息學(xué)分析結(jié)果與已報(bào)道文獻(xiàn)大致相符[16]。此外，通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一步生物信息學(xué)分析顯示ACTN4在腫瘤組織中的高表達(dá)與分期呈正相關(guān)，但是不同分期之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在生存預(yù)后分析中，結(jié)果顯示ACTN4高表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，表明ACTN4高表達(dá)可能提示患者預(yù)后不良。

注：A為T(mén)CGA數(shù)據(jù)庫(kù)中ACTN4在GC組織和正常組織中的表達(dá)，B為Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析中ACTN4基因與GC患者生存預(yù)后的關(guān)系，C、D為T(mén)CGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析ACTN4表達(dá)與GC分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系；與正常組織或Normal組比較，(1)P<0.001，(2)P<0.05。圖1 ACTN4生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of ACTN4

注：A、B分別為GC組織和GC細(xì)胞系中ACTN4 mRNA水平定量結(jié)果，C和D分別GC細(xì)胞系中ACTN4蛋白表達(dá)和定量結(jié)果；(1)與癌旁組織比較，P<0.05；與GES-1細(xì)胞比較，(2)P<0.001，(3)P<0.05。圖2 GC細(xì)胞系、GC組織及癌旁組織中ACTN4 mRNA和蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of ACTN4 mRNA and protein in gastric cancer cell lines and tissues

注：A、B分別為ACTN4蛋白表達(dá)和定量結(jié)果，C、D分別為細(xì)胞劃痕愈合面積和劃痕愈合率結(jié)果；與同時(shí)點(diǎn)sh-NC組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.05。圖3 敲低ACTN4后對(duì)AGS細(xì)胞遷移的影響Fig.3 Effect of ACTN4 knockdown in migration of AGS cells

通過(guò)qRT-PCR對(duì)腫瘤GC細(xì)胞系和GC組織ACTN4 mRNA和蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果佐證ACTN4在GC中表達(dá)失調(diào)，與生物信息學(xué)分析結(jié)果相契合。ACTN4基因的表達(dá)失調(diào)往往預(yù)示著一些腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生和病情的惡化，有研究顯示ACTN4參與腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)過(guò)程，進(jìn)一步顯示其與腫瘤侵襲遷移的關(guān)系[14,17-20]。腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程能夠促進(jìn)細(xì)胞的侵襲、遷移行為，而腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移往往提示患者病情較重、預(yù)后較差。EMT是指細(xì)胞由上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞過(guò)渡的一個(gè)生物學(xué)行為和狀態(tài)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)由上皮樣多邊形向間質(zhì)細(xì)胞樣長(zhǎng)梭形過(guò)渡，細(xì)胞間粘附連接破壞，上皮標(biāo)志物E鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N鈣黏蛋白、波形蛋白及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子鋅指E-box結(jié)合同源框1、Snail等表達(dá)上調(diào)，且EMT主要報(bào)道由Wnt/β-catenin等信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞變形運(yùn)動(dòng)[10,21-25]。因此腫瘤細(xì)胞EMT被認(rèn)為是腫瘤重要的生物學(xué)行為，是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的前置狀態(tài)。本研究體外敲低ACTN4基因構(gòu)建了AGS細(xì)胞系A(chǔ)CTN4敲低模型，并采用劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)該模型遷移能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示敲低ACTN4后AGS細(xì)胞遷移能力減弱(P<0.05)。雖然研究中未檢測(cè)EMT相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)變化，但是在敲低ACTN4后細(xì)胞遷移能力減弱，變形運(yùn)動(dòng)能力減低則有力佐證了ACTN4促進(jìn)GCAGS細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

結(jié)合生物信息學(xué)大數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果分析表明，ACTN4在GC細(xì)胞系A(chǔ)GS中高表達(dá)，ACTN4高表達(dá)能夠促進(jìn)AGS細(xì)胞系的遷移，與GC患者的生存預(yù)后呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究主要優(yōu)勢(shì)在于通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)，并結(jié)合組織和細(xì)胞模型驗(yàn)證以及構(gòu)建慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系對(duì)GC中ACTN4基因的功能進(jìn)行探索，但也存在一些不足，如未深入探索ACTN4的功能機(jī)制。