袁婷， 韋四喜， 夏英， 夏萬松， 李紅羽， 杜洪， 金泳， 黃海，***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗科, 貴州 貴陽 550001； 3.貴州省第二人民醫(yī)院 檢驗科， 貴州 貴陽 550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院， 貴州 貴陽 550004)

消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一是胃癌(gastric cancer，GC)，據(jù)2020年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計GC發(fā)病率排名第5，死亡率排名第4[1]。當(dāng)前，對GC發(fā)病機制的深入研究表明GC進展與多種分子水平變化有關(guān)，包括癌基因與抑癌基因的異常表達、非編碼RNA表達失調(diào)、腫瘤微環(huán)境改變及相關(guān)信號通路異常調(diào)節(jié)等[2]，使分子靶向治療在GC治療中具有重要作用。目前常用的靶向藥物是抗表皮生長因子受體抗體、抗血管內(nèi)皮細胞生長因子抗體及靶向程序性死亡受體-1(programmed cell death protein-1，PD-1)單克隆抗體等[3]。盡管國內(nèi)外研究已在這些靶向藥物治療中取得一定進展，但由于GC具有高度異質(zhì)性，仍有許多分子機制尚未進行深入研究，目前相關(guān)研究進展依然有限[4]。因此，尋找新的早期標(biāo)志物對GC治療具有重要作用，亦對研發(fā)治療GC新型藥物和靶向藥物具有重要意義。糖原代謝在腫瘤進展過程中具有重要作用，糖原是細胞中葡萄糖的貯存形式，其對能量供應(yīng)和體內(nèi)葡萄糖平衡至關(guān)重要[5]。調(diào)節(jié)糖原動員的關(guān)鍵酶是糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase，GP)，其有3種亞型，即腦型、肝型及肌型糖原磷酸化酶[6-9]。腦型糖原磷酸化酶(brain-type glycogen phosphorylase，PYGB)主要在成人大腦及胎盤組織中表達，一般認(rèn)為在人體應(yīng)激狀態(tài)(如缺氧、麻醉)時提供能量[10-12]；Xia等[13]研究發(fā)現(xiàn)PYGB在GC組織中表達顯著升高，沉默PYGB，可通過Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)途徑抑制GC細胞生長和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。然而，PYGB對GC細胞凋亡的影響及其機制目前尚不清楚。因此，本研究選擇GC細胞AGS為研究對象，主要探討PYGB對GC細胞凋亡的影響及其機制，從而能夠為PYGB開發(fā)為GC治療的新靶點提供理論和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1組織來源 收集2019年6月—2020年6月于胃腸外科接受手術(shù)治療的29例初診GC患者的癌組織及距腫瘤邊緣>5 cm的癌旁組織，GC患者在術(shù)前未進行放療和化療。29例GC組織中，男19例、女10例，年齡43～80歲、平均年齡(60.3±9.6)歲，據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會 (American Joint Committee on Cancer，AJCC) GC 腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(tumor node metastasis，TNM)病理分期標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ期3例、Ⅱ期5例、Ⅲ期14例及Ⅳ期7例。

1.1.2細胞來源 GC細胞系HGC-27(未分化)、MGC-803(低分化)、MKN45(低分化)、AGS(高分化)及人胃黏膜上皮細胞GES-1購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

1.1.3主要試劑和儀器 烏拉圭xy-cell胎牛血清(上海賽笠)，LipofectamineTM3000(美國Invitrogen)，Trizol試劑(上海生工)，逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription, RT)試劑和實時熒光定量 PCR(reverse transcription-quantitative PCR，RT-qPCR)試劑TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(日本TaKaRa)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate ddehydrogenase，GAPDH)兔源多克隆抗體(南京巴傲得)，PYGB兔源多克隆抗體(美國Abcam)，細胞周期檢測試劑盒(江蘇凱基)，細胞凋亡檢測試劑盒(上海七海)，活性氧檢測試劑盒(南京建成)；PYGB、次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine phosphoribosyl transferase，HPRT)引物由本課題組設(shè)計，上海生工生物工程股份有限公司合成，HPRT的引物序列為5′-ATGGCGACCCGCAGCCCT-3′(forward)和5′-CCATGAGGAATAAACACCCT-3′(reverse)，PYGB的引物序列為5′-CAGAACACGATGGTGAACCT-3′(forward)和5′-AGGTAGCCATTGAGTCAAGG-3′(reverse)，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中PYGB基因已知序列(ID5834)由上海吉瑪公司設(shè)計合成3對si-RNA序列，si-PYGB1序列為5′-GGAACUCGAGGAGAUAGAATT-3′(sense)和5′-UUCUAUCUCCUCGAGUUCCTT-3′(antisense)，si-PYGB2序列為5′-CCAGGGUCCUGUAUCCAAATT-3′(sense)和5′-UUUGGAUACAGGACCCUGGTT-3′(antisense)，si-PYGB3序列為5′-CCCUGUACAAUCGAAUCAATT-3′(sense)和5′-UUGAUUCGAUUGUACAGGGTT-3′(antisense)；同時設(shè)計亂序無意義陰性序列si-NC做為陰性對照，其序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3′(sense)和5′- ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′(antisense)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific)，Light Cycler 480TMRT-qPCR儀(瑞士Roche公司)，臺式冷凍離心機(美國Beckman Coulter)，F(xiàn)ACS Calibur型流式細胞儀(美國Becton，Dickinson)。

1.2 研究方法

1.2.1一般臨床資料收集 收集 29例GC患者性別、年齡、腫瘤侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期等一般臨床資料。

1.2.2細胞培養(yǎng) 從液氮罐內(nèi)取出GC細胞AGS、MKN45、HGC-27、MGC-803及人胃黏膜上皮細胞GES-1，快速融化，800 r/min離心3 min，棄上清；用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基3 mL重懸細胞，轉(zhuǎn)移至直徑60 mm細胞培養(yǎng)皿，放細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；48 h傳代，傳代比例1 ∶3；取對數(shù)生長期細胞用凍存液(含90%胎牛血清和10% DMSO溶液)凍存，4 ℃、 30 min，-20 ℃、 30 min，-80 ℃、 48 h，液氮罐內(nèi)長期保存。

1.2.3RT-qPCR檢測GC組織和細胞中PYGB的表達 GC組織和癌旁組織與GC細胞AGS、 MKN45、HGC-27、MGC-803及人胃黏膜上皮細胞GES-1中總RNA的提取根據(jù)Trizol試劑盒說明書操作；根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實時熒光定量PCR通過Light Cycler 480TM實時熒光定量PCR儀進行，用HPRT作為內(nèi)參基因，人胃黏膜上皮細胞GES-1作為對照，用2-ΔΔCt法于計算GC細胞中PYGB的相對表達量；癌旁組織作為對照組，用2-ΔCt法于計算GC組織中PYGB的相對表達量。將GC組織與其癌旁組織相比，檢測PYGB的表達，并以PYGB表達量的中位數(shù)作為臨界值，高于臨界值時視為高表達，低于臨界值時視為低表達[14]。

1.2.4蛋白印跡法(Western blot)檢測細胞內(nèi)PYGB的表達 收集GC細胞AGS、 MKN45、HGC-27、 MGC-803及人胃黏膜上皮細胞GES-1，提取細胞總蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分開后，轉(zhuǎn)移至0.45 μm的PVDF膜上，5%牛奶室溫封閉2 h，一抗GAPDH(1 ∶20 000)和PYGB(1 ∶1 000)于4 ℃搖床孵育過夜；TBST溶液洗膜3次、5 min/次，室溫孵育HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG(1 ∶20 000)二抗1 h，TBST溶液洗膜3次，5 min/次；用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，拍照保存。

1.2.5RT-qPCR和Western blot檢測AGS細胞轉(zhuǎn)染si-NC和si-PYGB 1～3后PYGB的表達 按“1.2.2”項下方法培養(yǎng)胃癌細胞AGS，待細胞長至對數(shù)生長期時接種于6孔板，根據(jù)RNA干擾技術(shù)合成的si-RNA序列將實驗分為Control組(空白對照)、si-NC組(陰性對照)、si-PYGB 1組(si-PYGB 1)、si-PYGB 2組(si-PYGB 2)和si-PYGB 3組(si-PYGB 3)，次日按LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染至48 h，分別收集各組細胞提取總RNA和總蛋白，采用RT-qPCR和Western blot檢測AGS細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染si-NC和si-PYGB 1～3后對PYGB表達的影響。根據(jù)轉(zhuǎn)染si-NC和si-PYGB 1～3后對PYGB表達的影響，在后續(xù)實驗中，si-PYGB 1～3對序列僅保留干擾效果最好的si-PYGB 2組，即后續(xù)實驗中僅有si-NC組和si-PYGB 2組。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測細胞周期、凋亡及細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平 按“1.2.2”項下方法培養(yǎng)胃癌細胞AGS，待細胞長至對數(shù)生長期時接種于6孔板，實驗分為si-NC組(陰性對照)和si-PYGB 2組(si-PYGB 2)，次日按LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染至48 h，收集2組細胞，1 000 r/min離心5 min，取細胞沉淀，分別根據(jù)細胞周期試劑盒、細胞凋亡試劑盒和ROS檢測試劑盒說明書染色，1 h內(nèi)上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PYGB mRNA和蛋白的表達

RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與人正常胃黏膜上皮細胞GES-1相比，在GC細胞AGS和MKN45中PYGB mRNA和蛋白的表達上調(diào)、而在HGC-27和MGC-803中表達下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。RT-qPCR結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，GC組織中PYGBmRNA表達上調(diào)(P<0.05)。見圖1。

注：A為GES-1和GC細胞系的RT-qPCR檢測結(jié)果，C為GES-1和GC細胞系的Western blot檢測結(jié)果，D為GC組織和癌旁組織的RT-qPCR檢測結(jié)果；(1)與GES-1比較，P<0.05； (2)與癌旁組織比較，P<0.05。圖1 GC細胞株、GC組織及癌旁組織中PYGB mRNA和蛋白的表達Fig.1 Expression of PYGB mRNA and protein in GC cell strains, GC tissues, and adjacent tissues

2.2 PYGB表達與GC患者臨床病理特征的關(guān)系

χ2檢驗結(jié)果顯示PYGB的表達水平與GC患者性別、年齡、腫瘤侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 PYGB表達與GC患者臨床病理特征的關(guān)系(n)Tab.1 Relationship between PYGB expression and clinicopathological characteristics of GC patients(n)

2.3 AGS細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染si-NC和si-PYGB 1～3后PYGB的表達

RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-PYGB 1組、si-PYGB 2組和si-PYGB 3組PYGB mRNA和蛋白表達水平下降(P<0.05)，而si-NC組與Control組比較、差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。由于si-PYGB 2組的干擾效果最好，因此后續(xù)實驗用si-PYGB 2組。見圖2。

注：A為RT-qPCR檢測PYGB mRNA表達，B、C為Western blot檢測PYGB蛋白表達；(1)與si-NC組比較，P<0.05。圖2 各組細胞中PYGB mRNA和蛋白的表達Fig.2 Expression of PYGB mRNA and protein levels in each group of cells

2.4 細胞周期

與si-NC組相比，si-PYGB 2組AGS細胞S期比例下降、G2/M期比例上升(P<0.05)，提示敲低PYGB誘導(dǎo)AGS細胞周期阻滯在G2/M期；si-NC組與si-PYGB 2組AGS細胞 G0/G1期比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.5 細胞凋亡

與si-NC組相比，si-PYGB 2組AGS細胞凋亡率上升(P<0.05)，提示敲低PYGB可誘導(dǎo)AGS細胞凋亡。見圖4。

注：A為AnnexinⅤ-FITC和PI熒光分布，B為細胞凋亡定量結(jié)果；(1)與si-NC組比較，P<0.05。圖4 敲低PYGB后各組AGS細胞凋亡Fig.4 Apoptosis of AGS cells in each group after knockdown of PYGB

2.6 ROS水平

與si-NC組比較，si-PYGB 2組AGS細胞內(nèi)ROS水平增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示敲低PYGB，誘導(dǎo)AGS細胞內(nèi)ROS水平增加。見圖5。

注：A為DCFH熒光分布，B為ROS含量占比；(1)與si-NC組比較，P<0.05。圖5 敲低PYGB后各組AGS細胞內(nèi)ROS水平Fig.5 ROS levels in AGS cells of each group after knockdown of PYGB

3 討論

GC是消化道最常見的惡性腫瘤之一，目前常規(guī)治療(如手術(shù)、化療及靶向治療)對患者療效有限，且根據(jù)不同分子類型及不同病理特征給予個體化治療，才能在GC患者治療上取得新進展[15-16]。因此，研究GC新的治療靶點具有重要意義。PYGB在多種腫瘤中異常表達，與腫瘤發(fā)生發(fā)展、腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移及預(yù)后不良相關(guān)[13，17-18]。本研究結(jié)果顯示PYGB在GC細胞AGS和MKN45及GC組織中表達上調(diào)，提示PYGB可能與GC發(fā)生有關(guān)。然而，χ2檢驗顯示PYGB高表達與GC患者性別、年齡、腫瘤侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)(P>0.05)，這與Xia等[13]研究發(fā)現(xiàn)PYGB在GC組織中表達顯著升高，并與GC患者的臨床病理特征(包括腫瘤大小、淋巴結(jié)受累及腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)呈正相關(guān)不一致，這可能與研究的樣本數(shù)量較少有關(guān)，需要收集更多GC組織來驗證這一結(jié)果。

腫瘤發(fā)生發(fā)展與腫瘤細胞的過度增殖、凋亡減少及細胞周期調(diào)控異常密切相關(guān)[19]。細胞周期遵循G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)及M期(分裂期)的發(fā)展規(guī)律[20]。本研究通過RNAi干擾技術(shù)下調(diào)AGS細胞中PYGB基因的表達后，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)AGS細胞周期阻滯在G2/M期并導(dǎo)致AGS細胞凋亡，提示PYGB可能成為GC治療的新靶點。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)PYGB在前列腺癌組織中表達上調(diào)，沉默PYGB可能通過影響核因子(nuclear factor κB，NF-κB)/核因子-類胡蘿卜素相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)信號傳導(dǎo)途徑進而抑制PC3細胞的細胞活力，且PYGB沉默還可增加PC3細胞中的ROS含量，進而促進PC3細胞凋亡。Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)PYGB在骨肉瘤組織及骨肉瘤細胞系MG63和HOS中高表達，沉默PYGB可通過阻斷含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)/B淋巴細胞瘤(b-cell lymphoma，Bcl)和細胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin dependent kinase 1，CDK1)信號傳導(dǎo)途徑，抑制骨肉瘤細胞增殖、侵襲和遷移，導(dǎo)致骨肉瘤細胞周期阻滯，促進骨肉瘤細胞凋亡。Wu等[21]研究發(fā)現(xiàn)沉默PYGB可通過激活蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)信號傳導(dǎo)途徑顯著減弱H9c2心肌細胞中高葡萄糖誘導(dǎo)的細胞凋亡和氧化應(yīng)激，并改善心肌細胞中的葡萄糖代謝，如糖原含量增加、葡萄糖消耗和葡萄糖轉(zhuǎn)運增加。Zhou等[22]研究發(fā)現(xiàn)PYGB在卵巢癌組織中表達上調(diào)，且PYGB高表達與卵巢癌患者預(yù)后差顯著相關(guān)，沉默PYGB可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路顯著抑制卵巢癌細胞增殖、侵襲、遷移及異種移植腫瘤形成；Xiao等[23]研究發(fā)現(xiàn)PYGB在非小細胞肺癌細胞系和組織中表達上調(diào)，過表達PYGB通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路促進非小細胞肺癌細胞增殖、遷移及侵襲，但抑制細胞凋亡，而這些作用可通過沉默PYGB有效逆轉(zhuǎn)。此外，Zhan等[24]研究發(fā)現(xiàn)沉默PYGB可通過激活磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/Akt信號通路抑制非小細胞肺癌的細胞活力、遷移及侵襲，并促進細胞凋亡，而這些作用可通過PYGB的過表達而有效逆轉(zhuǎn)。這些發(fā)現(xiàn)均表明，沉默PYGB可誘導(dǎo)細胞凋亡，提示PYGB可能成為腫瘤治療的新靶點。

本研究還發(fā)現(xiàn)RNAi干擾技術(shù)下調(diào)AGS細胞中PYGB基因的表達后，可誘導(dǎo)AGS細胞內(nèi)ROS水平增加。ROS是正常代謝和異源生物暴露的產(chǎn)物，過量ROS可誘導(dǎo)細胞大分子的氧化修飾，抑制蛋白質(zhì)功能并促進細胞死亡[25]。有文獻報道，細胞內(nèi)ROS水平增加時，促進細胞凋亡[26-27]。其機制可能是ROS形成促進線粒體釋放細胞色素c，導(dǎo)致細胞活力喪失，進而誘導(dǎo)細胞死亡；另一方面，ROS的產(chǎn)生可激活鞘磷脂酶，該酶作用于鞘磷脂產(chǎn)生神經(jīng)酰胺，進而激活細胞凋亡途徑[28]。因此，本研究提示沉默PYGB，可能是通過促進細胞內(nèi)ROS水平增加，進而誘導(dǎo)細胞凋亡。

總之，本研究表明PYGB在GC細胞AGS、MKN45及GC組織中表達上調(diào)，沉默PYGB可誘導(dǎo)AGS細胞周期阻滯在G2/M期，導(dǎo)致AGS細胞凋亡；沉默PYGB導(dǎo)致的AGS細胞凋亡與細胞內(nèi)ROS水平增加密切相關(guān)，提示PYGB可能成為GC治療的新靶點，也為GC治療提供新思路。在今后的研究中，應(yīng)該深入探討沉默PYGB，誘導(dǎo)GC細胞凋亡的作用機制，以期為GC治療提供理論和實驗基礎(chǔ)。