馬蒂達， 吳洋， 王顯， 蘇玉強， 顧勇

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院， 陜西 西安 710024； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院， 北京 100029； 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 心內(nèi)科， 北京 100700； 4.西安醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院, 陜西 西安 710021; 5.蘇州大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院， 江蘇 蘇州 215021)

心肌梗死(myocardial Infarction，MI)引起的心源性猝死是心臟疾病患者常見的死亡原因，梗死所致缺血缺氧可引起心肌細胞功能及代謝紊亂、氧自由基大量產(chǎn)生、細胞凋亡等病理變化，導(dǎo)致心肌細胞形態(tài)變化及心室重塑，在心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展中占有重要地位[1-2]。桃葉珊瑚苷為傳統(tǒng)中藥杜仲和玄參等的提取物，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等作用[3]。細胞實驗表明，桃葉珊瑚苷可以改善血管內(nèi)皮細胞炎癥損傷、抑制心肌細胞凋亡、減少心肌纖維細胞膠原合成[4-6]。動物實驗表明，桃葉珊瑚苷可調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、減少活性氧的積累、減輕MI小鼠心臟重塑[7]。由于中藥具有多靶標的特點，因此推測桃葉珊瑚苷還可能通過其他方式發(fā)揮心臟保護作用。NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小體在MI中具有重要作用，且抑制NLRP3可減輕炎癥反應(yīng)，并改善急性MI動物模型中的心肌功能障礙和重塑[8]。另有研究顯示，抑制AMP活化的激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通路可促進NLRP3/半胱氨酸酶(caspase1)小體活化，啟動細胞焦亡[9]。為探討桃葉珊瑚苷對NLRP3/caspase1小體介導(dǎo)的細胞焦亡的影響，本研究采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎法建立大鼠MI模型，觀察模型鼠心功能、組織學(xué)及某些炎癥因子的表達水平，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量220～250 g，購自江蘇百奧賽圖生物公司，許可證[SCXK(蘇)2016-0004]。飼養(yǎng)溫度(25±1)℃、濕度(55±5)%，12 h光照12 h黑暗條件下適應(yīng)飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(批準文號19001-6)且操作過程遵循動物保護3R原則。

1.1.2主要試劑及儀器 桃葉珊瑚苷(純度99.01%)、AMPK抑制劑Dorsomorphin(Compound C，CC，純度99.82%)，購自Selleck chemicals公司；小鼠源凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apotosis-associated speck-like protein，ASC)及β-actin抗體，購自Santa cruz公司；DAPI試劑、兔源AMPK、pro-caspase-1、胃泌素D-N(GSDMD-N)、NLRP3、p-AMPK抗體、羊源NLRP3抗體、驢抗羊IgG Alexa Fluor?488及羊抗兔IgG(Alexa Fluor?594)抗體，均購自Abcam公司；兔源cleaved-caspase-1購自Affinity Biosciences公司；羊抗兔、馬抗小鼠IgG(辣根過氧化物酶)抗體、兔源TXNIP抗體購自CST公司；紅四氮唑(TTC)、蘇木素伊紅(HE)染色試劑、伊文思藍(EB)、大鼠乳酸脫氫酶(LDH)、白介素(IL)-1β和IL-18 ELISA購自上海生工生物公司；熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司；酶標儀、電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)均購自美國BioRad公司；MyLab 30CV超聲成像儀購自Biosound Esaote公司。

1.2 研究方法

1.2.1模型制備 參照文獻[10]構(gòu)建大鼠MI模型。采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)將大鼠麻醉，監(jiān)測心電圖并連接呼吸機(潮氣量15 mL/kg，呼吸頻率70次/min)，打開左側(cè)胸廓，暴露冠狀動脈左前降支，采用5.0絲線結(jié)扎冠狀動脈和靜脈，觀察到左心室前壁心肌由紅變白、心電圖ST段抬高，代表成功復(fù)制MI模型。心臟迅速復(fù)位，縫合皮膚手術(shù)切口并消毒，連續(xù)3 d注射青霉素抗炎治療，正常喂養(yǎng)。若造模大鼠因死亡導(dǎo)致數(shù)量不足，則取備用大鼠補充，保證每組大鼠至少15只。另取15只大鼠僅暴露冠狀動脈不結(jié)扎，為假手術(shù)(Sham)組。

1.2.2大鼠分組及給藥 將MI大鼠分組為：MI組、MI+桃葉珊瑚苷組和MI+桃葉珊瑚苷+抑制劑組，每組15只。術(shù)后第4天，開始對MI組、MI+桃葉珊瑚苷組和MI+桃葉珊瑚苷+抑制劑組大鼠分別給予生理鹽水灌胃、100 mg/kg桃葉珊瑚苷灌胃、100 mg/kg桃葉珊瑚苷灌胃+0.2 mg/kg CC尾靜脈注射治療[11]，Sham組給予生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)14 d，進行后續(xù)實驗。

1.2.3超聲心動圖檢查 麻醉大鼠后，彩色超聲心動圖記錄左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室收縮壓(LV systolic pressure，LVSP)、左室收縮末期容積(LV end-systolic volume，LVESV)、左室短軸縮短率(LV fractional shortening，LVFS)、左室舒張壓(LV end-diastolic pressure，LVEDP)、左室舒張末期容積(LV end-diastolic volume，LVEDV)各項指標，測量3個連續(xù)心動周期，計算平均值。

1.2.4TTC-EB檢測 各組大鼠均隨機取5只過量麻醉處死，經(jīng)頸總動脈逆行注射0.5% EB溶液1 mL，分離取出心臟，于-20 ℃過夜保存。第2天，橫向?qū)⒆笮氖仪袨?片(厚約2 mm)浸沒于37 ℃ 1%、TTC溶液孵育20 min，用4%多聚甲醛固定后采用ImageProPlus分析各心臟切片梗死面積、計算梗死體積(正常心肌組織呈藍色，缺血心肌組織呈紅色，梗死心肌組織呈白色)。

1.2.5HE染色觀察 過量麻醉處死各組剩余10只大鼠，分離取出心臟，摘除脂肪等非心肌組織，于心室直徑最大處(包括梗死部分)取心肌組織，用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切成5 μm切片待測；另取余下梗死處及邊緣心肌組織切碎，經(jīng)液氮速凍后移至-80 ℃保存。

1.2.6免疫熒光法檢測 采用1.2.5中的心肌切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、通透后，采用2%山羊血清封閉，加入兔源cleaved-caspase1(1 ∶300)和羊源NLRP3(1 ∶200)一抗溶液4 ℃孵育過夜，避光加入羊抗兔IgG Alexa Fluor?594(1 ∶500)和驢抗羊IgG Alexa Fluor?488(1 ∶500)二抗溶液孵育50 min，避光加入DAPI試劑孵育5 min，加入封閉液封片后在熒光顯微鏡下觀察并記錄焦亡心肌數(shù)量，計算焦亡心肌細胞比例，每組至少10張切片，每個切片至少5個視野。

1.2.7心肌組織勻漿中IL-1β、IL-18及LDH水平 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測 取“1.2.5”項下中心肌冷凍樣品，制備勻漿液，加入IL-1β、IL-18及LDH的 ELISA試劑盒中相應(yīng)工作液、終止液后，于酶標儀450 nm處檢測各反應(yīng)孔吸光值，計算心肌勻漿液中IL-1β、IL-18及LDH水平。

1.2.8心肌相關(guān)蛋白表達水平 采用Western blot法檢測，取1.2.5中心肌組織(80 mg)在液氮中研磨，與RIPA試劑孵育后分離上清，使用BCA試劑盒定量上清中蛋白質(zhì)含量。均取30 μg蛋白經(jīng)過SDS-PAGE處理電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%牛血清蛋白封閉膜，在4 ℃下于AMPK(1 ∶2 000)、p-AMPK(1 ∶2 000)、GSDMD-N(1 ∶2 000)、pro-caspase1(1 ∶4 000)、NLRP3(1 ∶4 000)、ASC(1 ∶3 000)、cleaved-caspase1(1 ∶3 000)及β-actin(1 ∶5 000)抗體中孵育過夜；洗膜并在室溫下于抗兔或小鼠IgG二抗(1 ∶5 000)中孵育60 min。使用ECL試劑顯色后經(jīng)軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參照，計算AMPK、p-AMPK、pro-caspase1、NLRP3、ASC、cleaved-caspase1及GSDMD-N蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心功能指標

與Sham組相比，MI組、MI+桃葉珊瑚苷+抑制劑組LVEF、LVSP及LVFS降低，LVESV、LVEDP、LVEDV升高(P<0.05)；與MI組相比，MI+桃葉珊瑚苷組LVEF、LVSP、LVFS升高，LVESV、LVEDP、LVEDV降低(P<0.05)；與MI+桃葉珊瑚苷組相比，MI+桃葉珊瑚苷+抑制劑組LVEF、LVSP、LVFS降低，LVESV、LVEDP、LVEDV升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠心功能指標比較Tab.1 Comparison of cardiac function indexes among rats in each

2.2 心肌梗死體積

結(jié)果顯示，Sham組心肌無梗死；與Sham組相比，MI組、MI+桃葉珊瑚苷+抑制劑組心肌梗死體積增加(P<0.05)；與MI組相比，MI+桃葉珊瑚苷組心肌梗死體積減少(P<0.05)；與MI+桃葉珊瑚苷組相比，MI+桃葉珊瑚苷+抑制劑組心肌梗死體積增加(P<0.05)。見圖1和表2。

圖1 大鼠心肌TTC-EB染色結(jié)果Fig.1 TTC-EB staining results of myocardium in rats

表2 各組大鼠心肌梗死體積比較Tab.2 Myocardial infarction size of rats among rats in each

2.3 心肌組織學(xué)

如圖2所示，Sham組心肌細胞排列正常，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰,無壞死和炎癥細胞浸潤；MI組、MI+桃葉珊瑚苷+抑制劑組心肌細胞增大且排列混亂，可見大量炎癥細胞和部分血管擴張充血；MI+桃葉珊瑚苷組心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)較MI組、MI+桃葉珊瑚苷+抑制劑組清晰，心肌損傷程度較MI組、MI+桃葉珊瑚苷+抑制劑組減輕。

注：箭頭為炎性浸潤，藍色箭頭為血管充血。圖2 各大鼠心肌細胞形態(tài)(HE，×200)Fig.2 Cardiomyocyte morphology among rats in each group (HE, ×200)

2.4 心肌細胞焦亡情況

結(jié)果顯示，Sham組幾乎沒有焦亡心肌細胞；與Sham組相比，MI組、MI+桃葉珊瑚苷+抑制劑組心肌細胞焦亡比例增加(P<0.05)；與MI組相比，MI+桃葉珊瑚苷組心肌細胞焦亡比例降低(P<0.05)；與MI+桃葉珊瑚苷組相比，MI+桃葉珊瑚苷+抑制劑組心肌細胞焦亡比例增加(P<0.05)。見表3和圖3。

表3 各組大鼠焦亡心肌細胞比例Tab.3 Ration of pyroptotic cardiomyocytes among rats in each

2.5 心肌勻漿中LDH及炎癥因子水平

與Sham組相比，MI組、MI+桃葉珊瑚苷+抑制劑組IL-1β、IL-18及LDH水平增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與MI組相比，MI+桃葉珊瑚苷組IL-1β、IL-18及LDH水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與MI+桃葉珊瑚苷組相比，MI+桃葉珊瑚苷+抑制劑組IL-1β、IL-18及LDH水平增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠心肌勻漿中LDH、IL-1β及IL-18水平Tab.4 LDH,IL-1β,and IL-18 levels in myocardial homogenates among rats in each

2.6 AMPK/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達

與Sham組相比，MI組、MI+桃葉珊瑚苷+抑制劑組ASC、NLRP3、cleaved/pro-caspase1及GSDMD-N蛋白水平增高，p-AMPK/AMPK蛋白水平降低(P<0.05)；與MI組相比，MI+桃葉珊瑚苷組ASC、NLRP3、cleaved/pro-caspase1及GSDMD-N蛋白水平降低，p-AMPK/AMPK水平增高(P<0.05)；與MI+桃葉珊瑚苷組相比，MI+桃葉珊瑚苷+抑制劑組ASC、NLRP3、cleaved/pro-caspase1及GSDMD-N蛋白水平增加，p-AMPK/AMPK蛋白水平降低(P<0.05)。見表5和圖4。

表5 各組大鼠心肌組織AMPK/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達水平Tab.5 The expression levels of AMPK/NLRP3 pathway related proteins in myocardial tissues among rats in each

注：箭頭所指為焦亡心肌細胞。圖3 各組大鼠心肌免疫熒光結(jié)果(DAPI，×200)Fig.3 Results of immunofluorescence of myocardium among rats in each group(DAPI，×200)

注：A為Sham組，B為MI組，C為MI+桃葉珊瑚苷組，D為MI+桃葉珊瑚苷+抑制劑組。圖4 各組大鼠心肌組織AMPK/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達水平Fig.4 The expression levels of AMPK/NLRP3 pathway related proteins in myocardial tissues among rats in each group

3 討論

本研究通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支復(fù)制MI模型，結(jié)果顯示，MI模型大鼠LVEF、LVSP、LVFS降低，LVESV、LVEDP、LVEDV升高，心肌梗死體積約為(39.81±5.47)%，提示結(jié)扎冠狀動脈左前降支可阻斷心肌供血，造成心肌缺血性壞死損傷和心功能下降。MI通常伴隨炎癥細胞的積累及炎癥細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，進一步加重心肌損傷，導(dǎo)致心肌功能障礙和重塑[11-12]。細胞焦亡是一種炎癥相關(guān)的細胞程序性死亡方式，發(fā)生焦亡時，細胞體積膨大，細胞膜破裂形成孔洞、導(dǎo)致細胞內(nèi)容物釋放，形成活化焦亡小體，釋放炎性因子，又可進一步加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷等病理變化[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，MI后心肌勻漿液中LDH水平升高，表明心肌細胞膜受損；心肌組織中焦亡細胞比例及IL-1β、IL-18增多，可能引起心肌細胞死亡并促進心肌炎性損傷；HE染色顯示心肌細胞增大且排列混亂，有大量炎癥細胞和部分小血管擴張充血壞死，呈現(xiàn)明顯的炎性損傷，是導(dǎo)致心肌梗死和心功能下降的原因之一。Duan等[15]研究顯示，在脂多糖誘發(fā)的心臟損傷小鼠中，桃葉珊瑚苷可減輕心臟中炎癥，氧化應(yīng)激和細胞凋亡，改善其心臟功能。本研究結(jié)果顯示，MI后給予桃葉珊瑚苷可以提高大鼠心功能，減輕心肌組織中炎性損傷和細胞焦亡，并可抑制IL-1β、IL-18、LDH等釋放，提示桃葉珊瑚苷對MI損傷具有保護作用。

炎性小體的裝配是激活細胞焦亡過程中關(guān)鍵酶caspase-1的前提，細胞感受到危險信號后，NLRP3、銜接子ASC和pro-caspase-1會相互作用組裝為NLRP3炎性小體復(fù)合物，導(dǎo)致pro-caspase-1裂解為活性形式cleaved-caspase-1[16]。cleaved-caspase-1可以將非活性pro-IL-1β加工為成熟的IL-1β并促進其分泌，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和組織損傷[17]；同時將GSDMD催化裂解為GSDMD-N和GSDMD-C，GSDMD-N可以與細胞質(zhì)膜中磷酸肌醇結(jié)合，形成內(nèi)徑為10～20 nm的低聚致死孔，導(dǎo)致與炎癥相關(guān)的細胞焦亡[18]。上述過程受到AMPK的調(diào)節(jié)作用[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，MI模型大鼠心肌組織中p-AMPK、AMPK蛋白水平降低，ASC、NLRP3、cleaved/pro-caspase1、GSDMD-N蛋白水平增高，可能啟動NLRP3炎性小體復(fù)合物組裝，從而誘導(dǎo)心肌細胞炎性損傷和焦亡。MI后給予桃葉珊瑚苷可以提高p-AMPK/AMPK蛋白水平，降低ASC、NLRP3、cleaved/pro-caspase1、GSDMD-N蛋白水平，同時減輕心肌炎性損傷和細胞焦亡，提示桃葉珊瑚苷可以促進AMPK活化，抑制NLRP3小體形成，從而發(fā)揮對MI所致心肌損傷和心功能障礙的緩解作用。在桃葉珊瑚苷基礎(chǔ)上，應(yīng)用AMPK抑制劑，心肌勻漿中IL-1β、IL-18、LDH水平、焦亡細胞比例及心肌損傷程度升高，提示桃葉珊瑚苷可能通過調(diào)控AMPK/NLRP3通路降低炎性因子釋放和細胞焦亡，從而發(fā)揮對MI所致心肌損傷和心功能障礙的保護作用。

綜上所述，桃葉珊瑚苷可能通過活化AMPK，抑制NLRP3小體形成，減輕心肌細胞炎癥和焦亡，實現(xiàn)對MI大鼠心功能的改善。本文首次探究AMPK/NLRP3通路在桃葉珊瑚苷對MI大鼠心功能保護中的作用，進一步豐富了桃葉珊瑚苷的藥理機制。但是，中藥提取物作用靶點多樣，亦可能涉及別的機制，值得進一步完善。