邱 寒錢天 陽吳 彤王來栓△

（1國家兒童醫(yī)學(xué)中心/復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院新生兒科；2國家衛(wèi)生健康委員會新生兒疾病重點實驗室（復(fù)旦大學(xué)） 上海 201102）

早產(chǎn)是一個全球性的公共衛(wèi)生問題，全球每年每10個新生兒中就有一個早產(chǎn)（胎齡＜37周）［1-2］。隨著圍產(chǎn)新生兒救治水平的提高，早產(chǎn)兒的存活率越來越高［3］，但伴隨著較高的腦損傷風(fēng)險。據(jù)統(tǒng)計，約有25%～50%的早產(chǎn)兒在運動、視覺、認知等方面存在發(fā)育障礙［4］。而早產(chǎn)兒腦損傷的主要形式是早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷（preterm white matter injury，PWMI）［5］，約42.5%的腦癱患兒患有PWMI［6］。

PWMI主要的上游啟動損傷是缺氧缺血（hypoxia-ischemia，HI）或/和炎癥反應(yīng)，受累的主要靶細胞是少突膠質(zhì)前體細胞（oligodendrocyte precursor cell，OPC）［7］。OPC富含鐵、脂質(zhì)，氧化代謝率高，極易受到HI、炎癥等損傷的侵害［8］。損傷后，再生的OPC分化為成熟少突膠質(zhì)細胞（oligodendrocyte，OL），但難以形成髓鞘，最終導(dǎo)致髓鞘形成減少，影響沿軸突的快速傳導(dǎo)［9］。

關(guān)于損傷后OL成髓鞘障礙的原因尚不清楚。OL的成熟、成髓鞘受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。而Src家族激酶具有細胞增殖、促進神經(jīng)元分化和軸突生長等作用［10-11］。作為非受體酪氨酸激酶，Src家族激酶包含Src、Fyn、Yes、Lck、Lyn和c-Src等，其中Src、Fyn、Yes、Lck和Lyn已在哺乳動物的大腦中檢測到［12］，而發(fā)育期大腦已檢測到Src、Fyn和Yes［13］。研究表明Src家族激酶對OL的分化成髓鞘有至關(guān)重要的作用［14］。研究顯示，敲除Fyn激酶將會導(dǎo)致小鼠髓鞘生成明顯減少［15-16］。一項體外研究顯示，磷酸化c-Src的瞬時升高對于人神經(jīng)干細胞誘導(dǎo)分化成OPC至關(guān)重要［17］。雖然下游的機制各不相同，但Src家族激酶具有相同的結(jié)構(gòu)域，主要通過構(gòu)建開放構(gòu)象，使tyr 416位點磷酸化，從而產(chǎn)生活性［18］。但在PWMI中，對磷酸化Src激酶 的改變知之甚少。

在本研究中，我們在正常發(fā)育的大鼠中測定磷酸化Src激酶的表達，并明確其共定位細胞；對出生3天的SD大鼠進行HI處理，構(gòu)建大鼠缺氧缺血性腦白質(zhì)損傷模型，在模型鼠中測定磷酸化Src激酶的改變，以期為PWMI的治療提供理論基礎(chǔ)。

材料和方法

動物模型SD大鼠購自上海西普爾-必凱公司，飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實驗動物部。動物實驗通過復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院倫理委員會批準［批準號：復(fù)兒倫審（2020）515號］。每窩大鼠根據(jù)體質(zhì)量配平，隨機分為2組，分別為對照組和HI組，每組3～7只，共計46只。HI組SD大鼠出生3天后結(jié)扎右側(cè)頸總動脈，并使用6%氧氣缺氧2.5 h，建立大鼠缺氧缺血性腦白質(zhì)損傷模型。同窩對照組大鼠僅進行分離動脈的假手術(shù)，并未結(jié)扎和缺氧。

蛋白免疫印跡（Western blot，WB）在出生后6、10、17天（P6、P10、P17）處死大鼠，快速取出腦組織置于冰上，冠狀位切片，每片厚度2 mm，根據(jù)腦圖譜定位切取并收集胼胝體組織，或直接收取右側(cè)半腦。將取得的腦組織加入RIPA裂解液和蛋白酶磷酸酶抑制劑（美國Thermo公司），研磨徹底，12 000×g離心提取蛋白裂解液上清。使用BCA蛋白檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）測定蛋白質(zhì)濃度。將等量蛋白質(zhì)加到SDS-PAGE膠上分離，再轉(zhuǎn)至硝化纖維素濾膜上。使用5%牛血清室溫下封閉1 h，在4℃下與以下一抗雜交過夜：髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）（1∶1 000，美國Biolegend公司），β-actin（1∶5 000，愛必信（上海）生物科技有限公司），Src［pY416］（1∶1 000）和Src（1∶1 000）（美國CST公司）。第二天與HRP酶標二抗［1∶5 000，愛必信（上海）生物科技有限公司］在室溫下孵育1 h后顯影。

組織學(xué)檢查及蘇木精-伊紅（HE）染色用20%烏拉坦麻醉大鼠，灌注預(yù)冷的生理鹽水，再灌注預(yù)冷的4%多聚甲醛，取下全腦組織放于4%多聚甲醛中，4℃下固定過夜。使用20%和30%的蔗糖梯度脫水。采用冰凍切片機（CM1950，德國萊卡公司）冠狀切片，厚度約35 μm。采用HE染色，用光學(xué)顯微鏡（SZX7，日本奧林巴斯公司）分析。

免疫熒光染色切片使用0.1% Triton X-100滲透，5%牛血清白蛋白封閉。使用一抗MBP（1∶200，美國Biolegend公司）、PDGFRα（1∶200，美國BD Pharmingen?公 司），CC-1（1∶100，美 國Calbiochem公司），Src［pY416］（1∶100，美國CST公司）在4℃下孵育過夜，第二天再使用配對熒光偶聯(lián)二抗（1∶500，美國Alexa Fluor公司）室溫下孵育。采用DAPI（武漢塞維爾生物科技有限公司）檢測細胞核熒光信號。使用共聚焦熒光顯微鏡（TCSSP8，德國萊卡公司）觀察。

統(tǒng)計分析使用Image J軟件分析WB條帶的灰度值和免疫熒光強度。所有數(shù)據(jù)均采用±s表示。用Graphpad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析和Bonferroni法進行兩兩比較分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

胼胝體區(qū)磷酸化Src激酶的多時間表達已有研究證明在腦中磷酸化的Src激酶對于OL具有調(diào)節(jié)髓鞘形成的作用［15，19］。為了確定磷酸化的Src激酶在腦內(nèi)促進髓鞘形成的作用，我們首先使用WB評估大腦內(nèi)胼胝體中磷酸化Src激酶的表達。結(jié)果顯示胼胝體區(qū)域磷酸化Src激酶表達在P6、P10時處于高水平，而在P17天時磷酸化Src激酶的表達顯著下降（圖1A、1B），三組表達不全相等（F=7.446，P=0.024）。P6時磷酸化Src激酶的表達顯著高于P17天（圖1B）。這與OL成髓鞘的時間段相一致［20］。為了進一步驗證這一結(jié)論，我們使用磷酸化Src激酶（tyr416）進行熒光染色，可見P6、P10時的磷酸化Src熒光強度較強，而P17天的磷酸化Src熒光明顯減少（F=6.960，P=0.027）（圖1C、1D）。這與WB結(jié)果相一致。

圖1 胼胝體區(qū)磷酸化Src激酶多時間表達Fig 1 Expression of phosphorylation of Src kinases in corpus callosum region at different times

發(fā)育期間磷酸化Src激酶的OL來源OL發(fā)育成熟有4個階段：OPC、晚期OPC、髓鞘化前少突膠質(zhì)細胞和髓鞘化少突膠質(zhì)細胞［9］。標記物PDGFRα在OPC和晚期OPC（即未成熟OL）中表達，而CC-1標記物則在髓鞘化前少突膠質(zhì)細胞和髓鞘化少突膠質(zhì)細胞（即成熟OL）中表達［21］。因此為了進一步明確Src激酶在不同發(fā)育期OL的表達特點，我們使用PDGFRα，CC-1和磷酸化Src（tyr416）進行了三重免疫熒光染色，對P6、P10的時間點進行分析。P6、P10時，可見少量PDGFRα+的OPC，而CC-1+的OL遍布腦片。大部分磷酸化Src+的細胞與CC-1+的成熟OL共定位（圖2A、2B）。表明Src激酶活化主要與CC-1+的成熟OL共定位，對成熟OL以及之后的髓鞘形成有關(guān)鍵影響。

圖2 磷酸化Src激酶與少突膠質(zhì)細胞共染Fig 2 Phosphorylated Src kinases co-stained with oligodendrocytes

3日齡大鼠缺氧缺血性腦白質(zhì)損傷模型的建立為了研究PWMI中磷酸化Src激酶表達的改變，我們首先建立了3日齡大鼠缺氧缺血性腦白質(zhì)損傷的模型。造模后14天（即P17）時，可見HI組的損傷側(cè)半腦較對照組右腦稍萎縮（圖3A）。通過HE染色發(fā)現(xiàn)，造模后14天，HI組損傷側(cè)胼胝體變薄，神經(jīng)纖維排列紊亂、稀疏（圖3B）。WB結(jié)果顯示，造模后14天HI組損傷側(cè)胼胝體的MBP較對照組表達明顯減少（t=4.417，P=0.002）（圖3C、3D）。我們在HI損傷后14天對腦片進行MBP免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與WB結(jié)果一致，HI組的MBP熒光強度明顯降低（t=3.451，P=0.014）（圖3E、3F）。以上結(jié)果提示PWMI動物模型成功建立。

圖3 3日齡大鼠HI腦白質(zhì)損傷模型的建立Fig 3 Establishment of a 3-day-old rat model with HI cerebral white matter injury

Src激酶活化在3日齡大鼠缺氧缺血性腦白質(zhì)損傷模型中的改變?yōu)榱颂剿鱄I損傷后Src激酶活化的改變，WB結(jié)果顯示造模后3天（P6）時，HI組磷酸化Src的表達較對照組顯著減少（圖4A），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.629，P=0.000 7）（圖4D），而總Src蛋白保持不變。在造模后7天（P10）（圖4B）和造模后14天（P17）（圖4C）時，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4E、4F）。我們又使用免疫熒光染色對造模后3天的腦片進行分析。圖片顯示的結(jié)果與造模后3天的WB結(jié)果一致，HI組磷酸化Src的熒光表達減少（t=7.075，P=0.002）（圖4G、4H）。

圖4 Src激酶活化在3日齡大鼠缺氧缺血性腦白質(zhì)損傷模型中的表達改變Fig 4 Expressions of activated Src kinases in the 3-day-old rat hypoxia-ischemic white matter injury model

討 論

本研究首先確定了正常發(fā)育大鼠腦中胼胝體區(qū)域磷酸化Src激酶隨時間變化的趨勢，并且將其與OPC和成熟OL共染，發(fā)現(xiàn)磷酸化Src激酶主要與CC-1+的細胞共染，這表明Src激酶在腦內(nèi)活化水平與出生后早期發(fā)育期間的髓鞘形成密切相關(guān)。然后，我們在建立的3日齡大鼠缺氧缺血腦白質(zhì)損傷模型中發(fā)現(xiàn)，HI損傷會使P6時磷酸化Src激酶的表達明顯下降。

Src激酶作為非受體酪氨酸激酶，在腦內(nèi)廣泛表達，參與調(diào)控多種途徑的信號傳導(dǎo)，包括細胞黏附受體、整聯(lián)蛋白、受體酪氨酸激酶，以及G蛋白偶聯(lián)受體［22-24］。Src激酶具有調(diào)節(jié)細胞的形狀，遷移和黏附，存活、生長和分化的作用，使其成為多種疾病的重要治療靶標［25-27］。早在1994年，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Src激酶中Fyn在OL髓鞘化的過程中被激活，促進髓鞘形成［28］。在一篇病例報告中表明，Src同源2域含蛋白酪氨酸磷酸酶2的功能啟動子變異，與自發(fā)性早產(chǎn)本身、白質(zhì)中髓鞘形成以及神經(jīng)發(fā)育有關(guān)，可能導(dǎo)致早產(chǎn)兒的髓鞘發(fā)育遲緩和運動發(fā)育不良［29］。而在體外實驗中，通過培養(yǎng)原代OPC證實了Fyn在分化OPC時上調(diào)［30］，隨后在活躍的成髓細胞發(fā)生中下調(diào)［31］。本研究中Src激酶在大鼠正常發(fā)育腦內(nèi)活化具有相似的時間節(jié)律，其在發(fā)育早期達到峰值，而在髓鞘幾乎完全形成時迅速下調(diào)，且主要存在于成熟OL中，表明該節(jié)律可能與OL成髓鞘有重要關(guān)聯(lián)。

磷酸化Src激酶在未成熟腦內(nèi)對OL成髓鞘的作 用 已 得到證實［20，31］，但 在PWMI中 磷 酸 化Src激酶的改變尚不清楚。PWMI是造成早產(chǎn)兒各種神經(jīng)行為學(xué)障礙的重要原因之一，其基本病因涉及大腦發(fā)育不成熟，白質(zhì)區(qū)域的選擇性脆弱以及炎癥、HI損傷等［5，32］。體外實驗表明，缺氧30 min將導(dǎo)致90%的OL在9 h內(nèi)死亡［33］。HI損傷對于白質(zhì)的發(fā)育可能產(chǎn)生深遠的不利影響，HI損傷可以導(dǎo)致腦內(nèi)信號蛋白和營養(yǎng)素濃度的改變，如減少腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，這對于發(fā)育中的大腦以及OPC的分化至關(guān)重要［34-35］。而在我們建立的3日齡大鼠缺氧缺血性腦白質(zhì)損傷模型中，發(fā)現(xiàn)HI損傷后磷酸化Src激酶表達水平的下降可能影響到OL成髓鞘。以往研究發(fā)現(xiàn)，缺乏Src激酶或缺乏Src激酶活性都將導(dǎo)致小鼠體內(nèi)的髓鞘形成缺陷［15-16］。體外研究發(fā)現(xiàn)，在施萬細胞和背根神經(jīng)節(jié)共培養(yǎng)物中使用Src激酶抑制劑PP2將導(dǎo)致髓磷脂蛋白的減少，如MBP［36］。提示HI損傷后Src激酶活性的降低可能是導(dǎo)致OL成髓鞘障礙的重要原因之一。

越來越多的研究集中于Src激酶調(diào)節(jié)OL成髓鞘的機制。一項研究指出磷酸化Src激酶可能通過激活Erk1/2的磷酸化，從而介導(dǎo)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子促進OL成髓鞘［20］。另一項研究也顯示Src家族激酶參與GABA調(diào)節(jié)髓鞘形成［37］。在一項體外實驗中發(fā)現(xiàn)，高濃度的ATP增加了遷移OPC的數(shù)量，而BzATP（P2X7受體激動劑）的促進作用強于ATP，其作用可能是通過激活Fyn激酶而產(chǎn)生［38］。這些研究都表明，磷酸化Src激酶對OL成髓鞘的初始階段起關(guān)鍵作用，并與多種機制有關(guān)。而我們的結(jié)果顯示在HI損傷后磷酸化Src激酶表達水平的下降，可能影響到OL成髓鞘，但其機制尚未可知，有待將來進一步研究，為調(diào)控Src激酶增加理論基礎(chǔ)。

PWMI后OPC難以形成髓鞘的機制一直尚未明確。本研究探討了Src激酶活化在OL成髓鞘中扮演的重要角色，發(fā)現(xiàn)HI損傷后磷酸化Src激酶表達水平下降，可能是導(dǎo)致OL難以形成髓鞘的重要原因之一。未來我們將聚焦于外源干預(yù)Src激酶的活化，為HI損傷導(dǎo)致的PWMI提供治療策略。

作者貢獻聲明邱寒論文構(gòu)思、撰寫和修改，實驗操作，數(shù)據(jù)分析。錢天陽，吳彤實驗操作，數(shù)據(jù)分析。王來栓論文構(gòu)思，綜合指導(dǎo)。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。