蔡紫微，蔣佩文，張丹瑩，李敏惠，楊 平，趙 靜△

1.成都醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院(成都610500)；2.成都醫(yī)學院 檢驗醫(yī)學院(成都610500)；3.成都醫(yī)學院 藥學院(成都610500)；4.成都醫(yī)學院 科研實驗中心(成都610500)；5.成都醫(yī)學院 教務處(成都610500)

腦膠質(zhì)瘤是常見的原發(fā)性惡性腫瘤，我國腦膠質(zhì)瘤發(fā)病率為(5～8)/10萬人，病死率僅次于胰腺癌和肺癌[1]。臨床上，腦膠質(zhì)瘤的治療方式主要有手術、放化療及免疫治療等。由于腦膠質(zhì)瘤依賴彌漫浸潤性的生長模式及腫瘤本身復雜的異質(zhì)性，導致以上治療方式面臨高復發(fā)率、高病死率、靶向性較低、容易產(chǎn)生藥物抵抗等問題，使得腦膠質(zhì)瘤的治療效果仍處于較低水平[2]。據(jù)報道[3]，腦膠質(zhì)瘤患者的中位生存期低于其他腫瘤疾病，5年生存率僅9%左右。為提高治療效果、延長患者的生存期，尋找新型有效的抗腦膠質(zhì)瘤藥物非常必要。

甾體皂苷是由糖基和甾體皂苷元縮合而成的糖基皂苷，是多種藥用植物發(fā)揮生物學功能的主要活性結構，如從百合科植物七葉一枝花或云南重樓的干燥根莖中提取出來的重樓皂苷Ⅰ(polyphyllin Ⅰ，PPⅠ)、重樓皂苷Ⅵ(polyphyllin Ⅵ，PPⅥ)、重樓皂苷Ⅶ(polyphyllin Ⅶ，PPⅦ)以及從延齡草的根和根莖中分離的重樓皂苷Ⅶ(paris saponin Ⅶ，PSⅦ)[4]。重樓皂苷類化合物具有抗菌消炎、降低血壓等多種生理活性，藥用價值極高。研究[5]發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷類化合物在乳腺癌、肺癌、肝癌、骨肉瘤以及結腸癌中表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性，而對人腦膠質(zhì)瘤的作用報道較少。據(jù)此，本研究擬探討重樓皂苷類化合物PPⅠ、PPⅥ、PPⅦ以及PSⅦ對人腦膠質(zhì)瘤細胞LN229的增殖抑制作用,及PPⅦ抑制LN229細胞增殖的效應機制，以期為抗人腦膠質(zhì)瘤的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

PPⅠ(Cat.No.S9114)、PPⅥ(Cat.No.S9302)、PPⅦ(Cat.No.S9515)、PSⅦ(Cat.No.S9156)購自美國Selleck公司。

1.2 腫瘤細胞

人腦膠質(zhì)瘤細胞系LN229細胞，保存于成都醫(yī)學院科研實驗中心。根據(jù)美國組織培養(yǎng)庫推薦的培養(yǎng)方法，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)LN229細胞。

1.3 主要試劑

胎牛血清(Cat.No.10100147)、DMEM基礎培養(yǎng)基(Cat.No.11965-092)均購自美國Gibco公司；CCK-8檢測試劑盒(Cat.No.CK04)購自日本同仁化學研究所；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(Cat.No.KGA108-2)購自中國凱基生物公司；線粒體膜電位檢測試劑盒(Cat.No.MAK160)購自瑞士Roche公司；活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒(Cat.No.S0033)購自中國碧云天生物技術公司。

1.4 細胞增殖抑制實驗

取對數(shù)生長期的LN229細胞，以1.5×104個/孔的密度加入96孔細胞培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)至貼壁；加入供試的重樓皂苷類化合物，藥物濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0 μmol/L；作用24 h后，CCK-8法測定細胞OD值。用GraphPad Prism 7.0軟件分析并繪制藥物對LN229細胞的生長抑制曲線。

1.5 細胞內(nèi)ROS檢測

取對數(shù)生長期的LN229細胞，以5×105個/孔的密度加入6孔細胞培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)至貼壁；加入不同作用濃度的PPⅦ(0、1、2、4 μmol/L)處理24 h；收集LN229細胞，用DCFH-DA熒光探針進行染色，流式細胞儀(ACEA NovoCyte)檢測LN229細胞內(nèi)ROS水平。

1.6 細胞線粒體膜電位檢測

同“1.5”，PPⅦ作用后，收集LN229細胞，使用親脂性熒光探針JC-1進行染色，通過流式細胞儀檢測LN229細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrance poteintial,MMP)的變化情況。

1.7 細胞凋亡檢測

同“1.5”，PPⅦ作用后，收集LN229細胞，使用Annexin V-FITC/PI熒光染料對細胞進行染色，通過流式細胞儀檢測LN229細胞凋亡率。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 重樓皂苷類化合物對LN229細胞增殖的影響

重樓皂苷類化合物PPⅠ、PPⅥ、PPⅦ、PSⅦ的化學結構和分子式如下，可見PPⅠ、PPⅥ及PSⅦ的母核為偏諾皂苷元，而PPⅦ的母核為薯蕷皂苷元(圖1A)。CCK-8檢測結果表明，重樓皂苷類化合物均以濃度依賴性的方式抑制LN229細胞增殖。GraphPad Prism 7.0軟件繪制LN229細胞生長抑制曲線，求得PPⅠ、PPⅥ、PPⅦ、PSⅦ4種化合物24 h的IC50值分別為3.292、5.540、2.029、6.206 μmol/L，可見PPⅦ 的增殖抑制效果最佳(圖1B)。據(jù)此，進一步探討PPⅦ對LN229細胞發(fā)揮增殖抑制效應的機制。

圖1 藥物作用下人腦膠質(zhì)瘤細胞LN229生長抑制曲線

2.2 PPⅦ誘導LN229細胞形態(tài)發(fā)生改變

不同濃度的PPⅦ(0、1、2、4 μmol/L)作用LN229細胞24 h后，采用倒置顯微鏡成像法觀察LN229細胞形態(tài)的變化。研究發(fā)現(xiàn)，藥物作用后，LN229細胞形態(tài)呈現(xiàn)出典型的凋亡樣改變，即細胞縮小變圓、核固縮碎裂，同時細胞數(shù)量呈濃度依賴性減少(圖2)。

圖2 PPⅦ作用下LN229細胞形態(tài)學成像

2.3 PPⅦ對LN229細胞內(nèi)ROS水平的影響

用DCFH-DA熒光探針染色LN229細胞并用流式細胞儀檢測，結果發(fā)現(xiàn)PPⅦ增加LN229細胞內(nèi)ROS水平。和對照組相比，4 μmol/L 的PPⅦ處理后，ROS水平從(1.61±0.12)%增加到(10.44±0.24)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 PPⅦ作用下LN229細胞內(nèi)ROS水平檢測

2.4 PPⅦ誘導LN229細胞線粒體膜電位改變

使用流式細胞儀分析經(jīng)JC-1染色后的LN229細胞，發(fā)現(xiàn)在不同濃度的PPⅦ(0、1、2、4 μmol/L)作用下，LN229細胞MMP降低水平分別為(2.43±1.22)%、(6.05±1.37)%、(55.85±2.23)%、(85.16±1.70)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4)。

圖4 PPⅦ作用下LN229細胞線粒體膜電位檢測

2.5 PP Ⅶ誘導LN229細胞凋亡

PPⅦ處理24 h后，使用Annexin V-FITC/PI雙染法對LN229細胞進行染色，并通過流式細胞儀分析PPⅦ的凋亡誘導效應，結果發(fā)現(xiàn)PPⅦ以濃度依賴的方式誘導LN229細胞凋亡，在0、1、2、4 μmol/L的PPⅦ作用下，細胞凋亡率分別為(3.43±1.45)%、(9.50±1.47)%、(72.47±2.54)%、(87.27±1.68)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖5)。

圖5 PPⅦ作用下LN229細胞凋亡檢測

3 討論

腦膠質(zhì)瘤與周圍正常組織的界限模糊，單純的手術治療并不能有效改變患者生存期，輔以藥物治療仍是臨床上治療腦膠質(zhì)瘤的重要手段之一。由于現(xiàn)有藥物存在高劑量、高毒性的限制和藥物抵抗現(xiàn)象，因此迫切需要新型有效的抗腫瘤藥物[6]。有研究[7-8]發(fā)現(xiàn),白花丹素、黃連素、姜黃素等天然化合物有明顯的抗腦膠質(zhì)瘤活性，提示從天然化合物中開發(fā)新型有效的抗腫瘤藥物具有重要的臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷類化合物PPⅠ、PPⅥ、PPⅦ及PSⅦ均能有效抑制膠質(zhì)瘤細胞LN299增殖，其中PPⅦ的增殖抑制效果更明顯。

ROS是真核細胞有氧代謝產(chǎn)生的副產(chǎn)物，參與腫瘤細胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)[9]。線粒體作為ROS產(chǎn)生的重要部位，MMP的穩(wěn)定和細胞內(nèi)ROS水平密切相關[10]。ROS的累積能破壞線粒體膜，誘導MMP變化，而MMP 的穩(wěn)定有利于維持細胞的正常生理功能[11]。此前有關PPⅦ抗腫瘤活性的報道[12]主要圍繞AKT/mTOR信號通路，對ROS介導的抗腫瘤效應報道較少。有研究[13]指出，PP Ⅶ能通過ROS增加膠質(zhì)瘤U87-MG和U251細胞對替莫唑胺的敏感性。由于腫瘤異質(zhì)性的存在，不同腫瘤細胞間和相同腫瘤不同來源的細胞株間的基因與表型不同，導致同一種藥物在不同系別的腫瘤細胞上可表現(xiàn)出不一樣的治療效果及預后。因此，本研究通過DCFH-DA和JC-1染色檢測了LN229細胞內(nèi)ROS和MMP水平，發(fā)現(xiàn)PPⅦ增加LN229細胞內(nèi)ROS水平，并誘導LN229細胞MMP降低。此外，ROS能充當?shù)诙攀沟淖饔?，活化JNK信號通路下游的p53效應因子，最終激活促凋亡蛋白或抑制抗凋亡蛋白的轉(zhuǎn)錄，誘導細胞凋亡[14]。本研究通過Annexin V-FITC/PI染色，證實PPⅦ以濃度依賴的方式誘導LN229細胞凋亡，凋亡細胞比例從(3.43±1.45)%增加到(87.27±1.68)%?；谝陨涎芯拷Y果，推測PPⅦ可能通過ROS介導的線粒體凋亡途徑誘導LN229細胞凋亡。課題組后續(xù)將進一步探討PPⅦ作用，相關信號通路的活化及潛在作用靶點，并分析其對其他腫瘤細胞的增殖抑制作用。此研究將為臨床治療人腦膠質(zhì)瘤提供新思路，同時為PPⅦ的臨床應用提供新見解。