陳 媛，石 宇，鄭華斌

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，四川 成都 610075；2.重慶市北碚中醫(yī)院腫瘤科，重慶 400700；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院針灸科，四川 成都 611137)

功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D)是一種無器質(zhì)性改變的功能性胃腸病，具有起病緩、反復(fù)發(fā)作、病程長的特點(diǎn)，發(fā)病率約16%[1]。FD發(fā)病機(jī)理尚不明確，多與胃竇十二指腸運(yùn)動(dòng)紊亂、胃容受性舒張障礙、生活環(huán)境、精神心理狀態(tài)等有關(guān)[2]。目前尚無這一疾病根治方法，治療方式多以改善癥狀為主。大量研究證實(shí)[3]，針灸是治療FD的有效方法之一，“胃俞募配穴法”是FD針灸治療的經(jīng)典配穴。多項(xiàng)研究顯示下丘腦等區(qū)域在針刺治療胃腸道疾病中發(fā)揮了重要作用[4]。本課題組前期影像學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，胃俞募配穴能調(diào)節(jié)FD大鼠下丘腦異常改變的功能連接，改善FD大鼠的疾病狀態(tài)。故本研究在前期研究基礎(chǔ)上繼續(xù)以FD大鼠為研究對象，重點(diǎn)觀察電針胃俞募穴對FD大鼠下丘腦重要代謝產(chǎn)物的影響，探索電針治療的中樞響應(yīng)特征，為針刺胃俞募穴治療FD提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究于2018年2～11月完成。選用24只7日齡清潔級SD雄性大鼠乳鼠(合格證號：SCXK(川)2015-030號)，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。實(shí)驗(yàn)前期于成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行飼養(yǎng)，分裝于3個(gè)籠子中，每籠8只，每籠另配母鼠1只提供母乳喂養(yǎng)。為避免嚙齒動(dòng)物由母嬰分離引起的腸易激綜合征而干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在乳鼠出生后第22天后取走母鼠[5]。采用隨機(jī)數(shù)字表分為對照組、模型組及針刺組各8只；實(shí)驗(yàn)后期在武漢物理與數(shù)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)條件與前期一致。經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審批備案。

1.2 方法

1.2.1模型制作 模型組和針刺組大鼠采用0.1%碘乙酰胺(美國SIGMA公司)灌胃法、郭海軍夾尾打斗法和不規(guī)則喂食法制作FD動(dòng)物模型[6]。將混合液(0.1%碘乙酰胺+2%蔗糖)灌入大鼠胃中，灌胃量為0.2 ml/d，時(shí)間為6天。同時(shí)，對照組僅使用2%蔗糖溶液0.2 ml/d進(jìn)行灌胃，共6天；乳鼠正常喂養(yǎng)至7周齡后，采用夾尾應(yīng)激法及不規(guī)則喂養(yǎng)進(jìn)行造模。夾尾應(yīng)激法于每日上午9時(shí)、下午3時(shí)共實(shí)施兩次，每次30分鐘，共14天。夾尾前，用自制棉布包裹塑料夾，以免造成大鼠尾部皮膚嚴(yán)重破損而感染。在大鼠尾端1/3處放置塑料夾進(jìn)行夾尾刺激，激怒大鼠，與籠內(nèi)其他大鼠打斗。模型組和針刺組，行不規(guī)則喂養(yǎng)法，單日禁食，但保持足量飲水，雙日恢復(fù)飲食則給予足量食物及飲水；對照組以常規(guī)方式飼養(yǎng)，每日足量攝食飲水。

1.2.2干預(yù)方法 針刺組根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》(2016版)[7]選取“胃俞”穴(第13胸椎棘突下旁開約5 mm)和“中脘”穴(臍上約20 mm)進(jìn)行針刺。將大鼠用自制鼠衣固定后，使用0.25 mm×13 mm 毫針在“胃俞”穴直刺4～5 mm，在“中脘”穴直刺2 mm，隨后將兩個(gè)穴位與G6805-II電針儀(青島鑫生實(shí)業(yè)有限公司)相連，電針參數(shù)設(shè)置：波形為疏密波，頻率為2/100 Hz，電壓為2～4 V，頻率與電壓以大鼠不產(chǎn)生過激的反抗行為、穴位處肌肉組織隨電針刺激上下輕微抖動(dòng)為度，電針時(shí)間為20 min。連續(xù)治療10天，單日取左側(cè)胃俞穴，雙日取右側(cè)胃俞穴。模型組與對照組：在針刺組治療的同時(shí)，由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的針灸醫(yī)師，采用相同的方法進(jìn)行束縛固定，但不給予針刺刺激。于造模前當(dāng)天、造模后第二天上午8時(shí)、干預(yù)后第二天上午8時(shí)，觀察記錄三組大鼠的毛發(fā)狀況、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況以及糞便情況。于造模結(jié)束當(dāng)天上午8時(shí)以及針刺干預(yù)結(jié)束當(dāng)天上午8時(shí)，測量三組大鼠的體重并計(jì)算其體重增長量。同時(shí)，對每日進(jìn)食量、飲水量均進(jìn)行測定。測量胃泌素(Gastrin，GAS)時(shí)，采用酶聯(lián)免疫分析法(南京建成生物工程研究所大鼠胃泌素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒)分析。胃體重量稱取完畢后，計(jì)算胃排空率：胃排空率(%)=[灌胃量-(胃質(zhì)量-胃凈質(zhì)量)]/灌胃×100%。

1.2.3下丘腦組織代謝物測定 將取完胃的大鼠放入微波儀(唐山納源微博熱工儀器制造有限公司)進(jìn)行腦組織加熱固定后取出，分離下丘腦部位。將大鼠下丘腦組織進(jìn)行稱重、冷凍、振蕩離心、干燥、離心等步驟后，將干燥所得的固體溶于重水，進(jìn)行光譜分析。BrukerAvanceIII核磁共振波譜儀(德國BrukerBiospin公司)配有反向低溫探針，將其作為氫質(zhì)子磁共振波譜成像(H Proton Magnetic Resonance Spectroscopy，1H-MRS)儀器，磁場強(qiáng)度為600 MHz，將90°脈沖長度調(diào)至約10.1 μs，采集溫度設(shè)為298 K，隨機(jī)收集樣品的二維NMR光譜，包括J-分辨光譜(JRES)、1 h-1 h全相關(guān)光譜(TOCSY)、1 h-1 h相關(guān)光譜(COZY)等；在NMRSpec優(yōu)化程序中設(shè)置好峰對齊和整合后，測量波譜曲線，在相應(yīng)位置尋找下丘腦組織代謝物肌醇(Myo)、γ-氨基丁酸(GABA)、N-乙酰天門冬氨酸(NAA)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)、膽堿類化合物(Cho)、谷氨酰胺(Gln)等的特征性波峰；使用TOPSPIN軟件，選擇TSLP作為內(nèi)參，應(yīng)用積分算法測得各個(gè)化合物對應(yīng)的峰下面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間采用重復(fù)測量方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；非正態(tài)分布計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較造模前三組大鼠的外觀沒有明顯差別，精神良好、活潑好動(dòng)、毛發(fā)密集。造模后，大鼠大便開始變得稀溏，情緒急躁易怒、攻擊性增強(qiáng)；模型后期，大鼠出現(xiàn)活力下降、倦臥不語、毛發(fā)雜亂無光澤、大便臭穢稀溏，而對照組大鼠情緒穩(wěn)定、精神良好、大便成形，與前期比較無明顯變化。干預(yù)后，針刺組大鼠活力有所恢復(fù)，情緒狀態(tài)趨于穩(wěn)定、大便由稀轉(zhuǎn)干，臭穢程度減輕。模型組大鼠一般狀況有所改善，精神狀態(tài)逐漸恢復(fù)，但外觀方面毛發(fā)仍沒有光澤、形體消瘦、喜歡倦臥，大便稀溏較前稍改善。對照組大鼠無明顯改變。

2.2 三組體重、進(jìn)食、飲水量、胃排空率及胃泌素比較電針干預(yù)前，模型組和針刺組大鼠體重、進(jìn)食量、飲水量明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)后，針刺組大鼠體重、進(jìn)食量、飲水量較干預(yù)前明顯增加，較模型組也明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 干預(yù)前后大鼠體重日增長量、進(jìn)食、飲水量變化比較

2.3 三組胃排空率及胃泌素比較電針干預(yù)后，針刺組大鼠胃排空率高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。針刺組GAS水平較模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 干預(yù)后大鼠胃排空率及GAS水平比較

2.4 下丘腦區(qū)域重要代謝產(chǎn)物比較電針干預(yù)后，模型組下丘腦區(qū)域Myo值明顯低于對照組和針刺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組和針刺組Ala值均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表3。

圖1 干預(yù)后三組大鼠下丘腦重要代謝產(chǎn)物波譜圖 a：Ala；b：Gln；c：choline；d：Glu；e：NAA；f：GABA-C4；g：Gly；h：Asp；i：GABA-C3；j：Myo-C1C3；k：Myo-C2；l：Myo-C4C6

表3 干預(yù)后大鼠下丘腦區(qū)域重要代謝產(chǎn)物濃度比較 (μmol/g)

3 討論

FD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，不僅與腦區(qū)異常功能結(jié)構(gòu)變化及腦部神經(jīng)遞質(zhì)異常表達(dá)有關(guān)，而且其外周機(jī)制與也多種激素有關(guān)，如腦腸肽的GAS、生長抑素、血管活性腸肽以及胃饑餓素等。其中，血管活性腸肽、生長抑素主要存在于下丘腦中。下丘腦是間腦的一部分，具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、自主神經(jīng)、體溫、食物攝入、晝夜節(jié)律、情緒活動(dòng)等功能?？挂钟羲帄W氮平治療FD是通過調(diào)節(jié)Nesfatin-I一種新型厭食肽發(fā)揮作用，而Nesfatin-I也被證實(shí)廣泛分布于下丘腦室旁核、下丘腦外側(cè)區(qū)等腦區(qū)[8]。

多項(xiàng)針刺治療胃腸道疾病的中樞機(jī)制研究[9～11]表明，下丘腦在FD的疾病進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，針刺可以通過調(diào)節(jié)下丘腦結(jié)構(gòu)和功能的改變實(shí)現(xiàn)對FD的治療作用：針刺通過調(diào)節(jié)FD大鼠下丘腦中血管活性腸肽含量改善其疾病狀態(tài)，降低FD大鼠下丘腦等部位中胃促生長蛋白的表達(dá)，通過中樞途徑及外周途徑，促進(jìn)胃腸動(dòng)力，改善胃腸道活動(dòng)。以上研究均證實(shí)了針刺對FD大鼠下丘腦的調(diào)整作用，這也與本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證。

本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠下丘腦組織的Myo、Ala表達(dá)減少，針刺干預(yù)后針刺組大鼠下丘腦組織的Myo物質(zhì)表達(dá)顯著增高。Ala有α-alanine和β-alanine兩種同分異構(gòu)體，可組成人體蛋白質(zhì)。其中β-alaninebei被證實(shí)可以通過多巴胺來進(jìn)行大鼠食欲的調(diào)控，本次實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠下丘腦Ala濃度小于對照組大鼠，且前者的體重增長量、進(jìn)食量、飲水量均小于后者，F(xiàn)D模型制備成功后可能抑制了大鼠下丘腦中β-alanine的分泌，從而造成食欲的下降，最終使大鼠體重增長量、進(jìn)食量、飲水量均有不同程度的下降，這也表明FD相關(guān)癥狀的產(chǎn)生可能與Ala的同分異構(gòu)體β-alanine減少有關(guān)[12]。

Myo是一種類維他命物質(zhì)，研究顯示[13]口服Myo可在人體中起到抗抑郁的作用。本研究中，模型組大鼠下丘腦Myo濃度小于對照組，同時(shí)模型組大鼠的一般情況均差于對照組，這說明模型組大鼠下丘腦中Myo濃度下降，抗抑郁作用降低，從而使大鼠情緒低落，最終造成大鼠一般情況變差，體重降低，進(jìn)食量減少等癥狀。精神因素也是FD一個(gè)重要致病因素[1]。本研究針刺干預(yù)后大鼠下丘腦Myo濃度較模型組增加，同時(shí)前者的一般情況、體重變化、進(jìn)食量等也較后者好，結(jié)果提示針刺治療可能通過增加大鼠下丘腦Myo濃度來調(diào)節(jié)大鼠胃容量變化以及改善大鼠的情緒狀態(tài)，這課題組前期研究相呼應(yīng)[14]。

綜上所述，本研究FD大鼠出現(xiàn)下丘腦中Myo、Ala表達(dá)降低，而電針胃俞募穴能夠改善FD大鼠的一般情況、體重增長量等指標(biāo)，可能與針刺影響下丘腦Myo、Ala代謝物的表達(dá)來調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)有關(guān)。