張凱悅，來歡歡，閆 璐，趙 微，毛 健，張秀紅，*

（1.山西師范大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004；2.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004；3.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

食醋是日常生活中常見的一種調(diào)味品[1]。中國(guó)醋多以淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)，北方多用高粱玉米南方多用大米[2]，都需要將淀粉降解為還原糖，酵母菌轉(zhuǎn)化為乙醇，再由醋酸菌將乙醇氧化為醋酸[3-5]。起淀粉降解作用的糖化劑有多種，如大曲[6]、小曲[7]、藥曲[8]、紅曲[9]和麩曲[10]等。由多種微生物多種酶組成的大曲，糖化力相對(duì)不是很高，生產(chǎn)中用量大，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，成品醋品質(zhì)較好[6]。而小曲、藥曲、紅曲等和麩曲中微生物種類少，甚至是純種微生物，糖化力較高，用量少，安全性高，但種曲制作技術(shù)要求比較高[11-12]。麩曲是黑曲霉純種曲，可頂替部分大曲，也可全部使用麩曲釀醋，是一種非常重要的糖化劑[13-15]。

麩曲使用時(shí)先由黑曲霉孢子懸液接種麩皮固態(tài)培養(yǎng)基制成種曲，再由種曲接種麩皮制成提供糖化力的麩曲[16]。麩曲的作用是降解淀粉，最重要的生化指標(biāo)就是糖化力。種曲作為生產(chǎn)用麩曲的種子，主要是提供大量的優(yōu)質(zhì)孢子，而菌種退化是不可避免的現(xiàn)象[17]，通過黑曲霉孢子的多少及顏色判斷菌種是否退化，也經(jīng)常被一線生產(chǎn)人員用來間接判斷麩曲的質(zhì)量[18]。但關(guān)于黑曲霉產(chǎn)孢能力與糖化力相關(guān)性的研究較少，周樂民等[19]用紫外線對(duì)黑曲霉誘變育種時(shí)發(fā)現(xiàn)，黑曲霉a和b菌株的糖化力分別增加了1.6倍和6～8倍，但突變株在菌株形態(tài)、生長(zhǎng)速度、孢子形成等方面都沒有可觀察到的變化；肖雷等[20]在分析影響黑曲霉糖化酶和蛋白酶的營(yíng)養(yǎng)因素時(shí)發(fā)現(xiàn)，黑曲霉產(chǎn)孢子能力對(duì)于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)需求與蛋白酶類似，與糖化酶關(guān)系不大，如培養(yǎng)基隨著淀粉含量增加，可誘導(dǎo)糖化酶活性提高，產(chǎn)孢子數(shù)量卻有所下降。不同黑曲霉菌株產(chǎn)孢能力與糖化力關(guān)系尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)比較分析黑曲霉的孢子性狀及其麩曲糖化力的大小的關(guān)系，為釀醋過程中麩曲質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與試劑

麩曲：由山西省臨汾市某醋廠提供。

麩皮、土豆：市售；硝酸鈉、無水乙酸鈉、碘化鉀、戊二醛、葡萄糖、蔗糖、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；可溶性淀粉（生化試劑）、硝酸銨、硫酸銨、磷酸氫二銨、無水乙醇、碘（均為分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙酸異戊酯（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良查氏培養(yǎng)基：以査氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，改蔗糖30 g為可溶性淀粉20 g、蔗糖10 g，補(bǔ)加硝酸銨2 g。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL。

麩皮浸出液培養(yǎng)基：按照參考文獻(xiàn)[21]配制。

麩皮固態(tài)培養(yǎng)基：麩皮經(jīng)20目篩子過篩，留篩子內(nèi)的大片麩皮。麩皮∶水=10∶9（g∶mL），攪拌均勻，置于500 mL三角瓶?jī)?nèi)，每瓶30 g，用紗布和報(bào)紙封口。

上述培養(yǎng)基均于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：榮華儀器制造有限公司；HH.CP-01型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、YXQ-LS-50SII立式蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；752N紫外可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；SK200生物顯微鏡：麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；PHS-3C型pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；JSM-7500F型掃描電子顯微鏡：日本電子株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉的分離純化鑒定

稱取麩曲，制成孢子懸液，稀釋到合適濃度，吸取1 mL孢子懸液分別接種于改良查氏、PDA和麩皮浸出液培養(yǎng)基培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》中黑曲霉的形態(tài)描述，挑選菌落絨狀呈圓形、菌絲致密、分生孢子頭明顯、孢子較黑或產(chǎn)黃色色素的單個(gè)菌落[22]，以此方法純化3～5代，觀察菌落及顯微特征，確認(rèn)純種曲霉后，接種于試管斜面，4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

將分離到的10株曲霉接種到改良査氏培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d后，對(duì)其進(jìn)行18S rDNA-ITS區(qū)域測(cè)序，所得序列拼接校準(zhǔn)對(duì)齊后，于美國(guó)國(guó)家生物信息中心（national center for biotechnology，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)通過基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.3.2 種曲和麩曲制備及產(chǎn)孢量分析

[32]Soroush Vosoughi, Deb Roy, Sinan Aral, “The spread of true and false news online”, Science, 2018, 359(6380), pp. 1146-1151.

將黑曲霉孢子接于麩皮固體培養(yǎng)基中攪拌均勻，30 ℃培養(yǎng)，16 h時(shí)搖瓶以防結(jié)塊，35 h后扣瓶培養(yǎng)，3～5 d后40 ℃烘干即為種曲。種曲以0.5%的接種量轉(zhuǎn)接到麩皮固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，30 ℃培養(yǎng)1～2 d，即為麩曲。

稱取適量種曲于105 ℃條件下干燥3 h至質(zhì)量恒定，準(zhǔn)確稱取0.2 g絕干曲，制成孢子懸液，稀釋到合適的濃度，使用血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)孢子數(shù)，最后計(jì)算孢子濃度，個(gè)/g。

1.3.3 黑曲霉分生孢子頭形態(tài)觀察

黑曲霉菌落培養(yǎng)后參考《現(xiàn)代食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，收集菌體、固定、脫水，經(jīng)過50 ℃干燥2 h后制樣、噴金，進(jìn)行電鏡觀察[23]。

1.3.4 黑曲霉糖化力分析

水解圈測(cè)量：根據(jù)劉茗銘等[24]的方法，略有修改。向無菌培養(yǎng)皿中準(zhǔn)確倒入15 mL固體培養(yǎng)基，凝固后點(diǎn)種黑曲霉，30 ℃培養(yǎng)至合適的時(shí)間，滴加約7 mL稀碘液，一定時(shí)間后測(cè)量淀粉水解圈直徑（D）和菌落直徑（d），并且計(jì)算D/d值。

糖化力測(cè)定[25-27]：使用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosal icylic acid，DNS）比色法測(cè)麩曲糖化力。糖化力定義為1 g絕干曲在40 ℃、pH4.6條件下，糖化淀粉1 h生成葡萄糖的毫克數(shù)，U。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉的分離純化及鑒定

用改良查氏、PDA和麩皮浸出液三種培養(yǎng)基從釀醋麩曲中分離純化出10株曲霉，分別記為D2、D7、D11、D14、D17、N1、N3、AW1、AY1和AY2。10株曲霉菌落直徑約68～80 mm，菌株N1、N3、AY1和AY2產(chǎn)黃色色素，其中AY2產(chǎn)色素最多。

表1 曲霉菌的鑒定Table 1 Identification of Aspergillus strains

2.2 10株黑曲霉產(chǎn)孢子能力分析

食醋釀造過程中，黑曲霉麩曲培養(yǎng)時(shí)是用種曲孢子接種的，黑曲霉產(chǎn)孢子能力直接影響生產(chǎn)過程。10株菌制備的種曲顏色明顯不一致，菌株AY1、AY2和N1顏色較淺呈淡黃色，其余明顯轉(zhuǎn)為黑色，深淺略有不同。10株黑曲霉制備種曲產(chǎn)孢量比較見圖1。從圖1可知，菌株AW1、N3、D11、D2制備種曲產(chǎn)孢量較多，分別為9.55×109個(gè)/g、9.35×109個(gè)/g、8.97×109個(gè)/g和8.8×109個(gè)/g，兩者之間沒有顯著性差異（P＞0.05）；菌株AY1、AY2制備種曲產(chǎn)孢量較少，分別為1.95×108個(gè)/g和4.13×108個(gè)/g。

圖1 10株黑曲霉制備種曲產(chǎn)孢量對(duì)比Fig.1 Comparison of spore yield of 10 Aspergillus niger strains in Zhongqu

2.3 黑曲霉分生孢子頭形態(tài)觀察

進(jìn)一步用電鏡觀察孢子較多的AW1和N3，孢子較少的AY1和AY2的分生孢子頭，結(jié)果見圖2。由圖2可知，AW1和N3的分生孢子頭略大一點(diǎn)，小梗緊實(shí)，AY1和AY2的分生孢子頭略小，小梗較松散，N3有很多孢子釋放后留下的小孔。

圖2 黑曲霉菌株AW1、N3、AY1、AY2分生孢子頭微觀形態(tài)Fig.2 Microscopic morphology of conidia head of Aspergillus niger strains AW1,N3,AY1 and AY2

2.4 10株黑曲霉糖化力分析

用水解圈法定性分析了10株黑曲霉的糖化力，計(jì)算其水解圈與菌落直徑比（D/d），結(jié)果見表2。由表2可知，菌株AY1、N3的D/d值最高，分別為2.364、1.286。

表2 10株黑曲霉的D/d值Table 2 D/d value of 10 strains of Aspergillus niger

把10株黑曲霉制成麩曲，30 ℃培養(yǎng)36 h后測(cè)量糖化力大小，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株AY1、N3的糖化力最高，分別為3158.2 U、2991.9 U；菌株D2最低，僅為1 426.5 U；定量分析結(jié)果整體與定性分析的水解圈/菌落直徑比相符。但是高糖化力菌株與產(chǎn)孢子多的菌株沒有表現(xiàn)出相關(guān)性，與周樂民等[19-20]的研究結(jié)果一致；推測(cè)糖化酶基因與孢子形成基因單獨(dú)存在，互不影響。

圖3 10株黑曲霉制備麩曲糖化力對(duì)比Fig.3 Comparison of saccharifying power of Fuqu produced by 10 Aspergillus niger strains

3 結(jié)論

麩曲醋釀造中是用純種黑曲霉麩曲作為糖化劑，實(shí)際生產(chǎn)中由于連續(xù)傳代及種曲的開放式培養(yǎng)，很容易導(dǎo)致菌種退化或污染。為了研究釀醋用黑曲霉產(chǎn)孢能力與糖化力的相關(guān)性，從釀醋麩曲中分離純化鑒定了10株黑曲霉，比較了10株黑曲霉種曲的顏色，定量分析其產(chǎn)孢能力。結(jié)果表明，菌株AW1、N3、D11、D2種曲顏色較黑，產(chǎn)孢量較多，分別為9.55×109個(gè)/g、9.35×109個(gè)/g、8.97×109個(gè)/g和8.8×109個(gè)/g，而AY1、AY2種曲顏色淺，產(chǎn)孢量較少，分別為1.95×108個(gè)/g和4.13×108個(gè)/g；用電鏡觀察產(chǎn)孢能多的AW1和N3，以及產(chǎn)能孢少的AY1和AY2的分生孢子頭，前者分生孢子頭略大一點(diǎn)，小梗緊實(shí)，后者分生孢子頭略小，小梗疏松。

用水解圈定性分析10株黑曲霉糖化力時(shí)，水解圈與菌落直徑比（D/d）較大的菌株為AY1和N3，較小的為D2和D11，其D/d比值分別為2.364、1.286、1.091、1.128；定量分析結(jié)果與定性分析吻合，糖化力大的為AY1、N3，其糖化力分別為3 158.2 U、2 991.9 U，糖化力小的仍然是D2，僅有1 426.5 U。

結(jié)合10株黑曲霉產(chǎn)孢能力和糖化力發(fā)現(xiàn)，菌株N3產(chǎn)孢子較多，糖化力也較高，但菌落長(zhǎng)勢(shì)快、孢子多且黑的菌株D2糖化力卻比較低；菌落長(zhǎng)勢(shì)慢、孢子不明顯的菌株AY1糖化力又比較高，可見產(chǎn)孢能力和糖化力是黑曲霉兩個(gè)獨(dú)立的性狀，并不能簡(jiǎn)單根據(jù)黑曲霉孢子的多少和顏色來判斷其糖化力高的大?。粚?shí)際生產(chǎn)中還需要專業(yè)人士用專門方法對(duì)麩曲糖化力分析以判斷麩曲質(zhì)量。