鄭慶禮 潘書磊 劉秉琿 福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院 福州 350119

犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）可感染多種動物，可導(dǎo)致80%病死率[1]。該病毒可感染犬科類、鼬科和浣熊類動物，近年來發(fā)現(xiàn)大熊貓也可感染[2]。犬瘟熱主要發(fā)生于5月齡以下，臨床癥狀表現(xiàn)復(fù)雜多樣，主要癥狀包括白細(xì)胞減少、雙相熱、咳嗽流鼻涕和腹瀉便秘等，某些病例還可能會出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、肌肉強(qiáng)直等神經(jīng)癥狀[3-4]。CDV是副粘膜病毒科RNA病毒，全基因組大約包含16689 bp，存在6個結(jié)構(gòu)蛋白，其中N基因編碼的N蛋白已被證明在疾病的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中起著十分關(guān)健的作用，同時是比較保守的免疫原性蛋白，可以有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[5-7]。目前還未見有人對CDV的N基因進(jìn)行清晰的生物信息學(xué)分析，因此本文通過臨床病料分離CDV，并把該病毒的N基因克隆測序后進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，為今后N基因抗原多表位疫苗的研究提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品 臨床送檢犬瘟熱病料。

1.2 主要試劑與儀器 主要試劑有病毒RNA提取試劑盒，基因克隆試劑盒，高保真PCR mix（購自北京全式金生物技術(shù)有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自Promega生物科技有限公司）。主要儀器有PCR擴(kuò)增儀（T100，購自伯樂Bio-Rad），水平電泳系統(tǒng)（DYCZ-24KS，購自北京六一生物科技有限公司）。

1.3 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI上GenBank公布的CDV核酸序列(AB932517.1)，利用Oligo7設(shè)計特異性常規(guī)引物CDV-Ngene F:atggctagccttctcaagag；CDV-Ngene R:gtagctctctatcattatagacaggag，引物由上海生物工程股份有限公司合成。

1.4 CDV核酸提取及N基因克隆 根據(jù)操作說明書提取病料RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，合成引物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系見表1。將擴(kuò)增結(jié)果凝膠電泳并拍照保存。

表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件及體系

對PCR產(chǎn)物根據(jù)操作說明進(jìn)行膠回收純化，將PCR產(chǎn)物與pEASY-T1克隆載體室進(jìn)行連接。連接結(jié)束后將載體轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中并置于LB瓊脂平板培養(yǎng)過夜。第2 d挑菌進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定正確的PCR產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)有限公司測序。

1.5 CDV N基因生物信息學(xué)分析 利用DNA Star、DNA MAN對CDV N基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹和同源性分析；利用DNAMAN分析CDV N基因親疏水性，跨膜性和抗原位點；利用利用在線軟件GOR4預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.Pl page=npsa_gor4.html)；利用Net-NG-Lyc1.0和NetPhos 2.0在線分析軟件預(yù)測N-糖基化位點和磷酸化位點；利用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測CDV N基因的三級結(jié)構(gòu)(https://swissmodel.expasy.org/interactive)。

2 結(jié) 果

2.1 CDV N基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 根據(jù)凝膠電泳結(jié)果顯示，在1572 bp左右位置出現(xiàn)明顯的特異性條帶（見圖1），與預(yù)期相符合。

圖1 CDV基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 CDV N基因遺傳進(jìn)化樹及同源性分析 將CDV N基因克隆測序，將測序結(jié)果命名為FJ-CDVN gene并與NCBI庫的參考序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹及進(jìn)行同源性分析，分析結(jié)果表明（見圖2-圖3）：測序得到的FJ-CDV-Ngene株與11株參考序列同源在96.9%～99.2%，其中與HM596310.1的同源性最高，同源性為99.2%，與MT136724.1的同源性最低，同源性為96.9%。

圖2 CDV基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 FJ-CDV-Ngene株同源性分析

2.3 CDV N蛋白N-糖基化及磷酸化位點預(yù)測利用NetNGlyo1.0在線分析軟件對CDV N蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，分析結(jié)果顯示該蛋白不存在N-糖基化位點。利用Netphos2.0在線軟件分析結(jié)果顯示（見圖4），CDV N基因氨基酸序列存在32個絲氨酸位點，分別位于第3,7,75,78,83,98,122,125,169,191,228,243,290,298,325,328,355,372,377,395,399,414,422,439,465,469,471,489,504,509,512,513位點；存在15個蘇氨酸位點，分別位于9,14,115,200,290,272,279,294,347,402,409,434,460,500,508位點；存在5個酪氨酸位點，分別位于199,260,306,311,516位點。

圖4 CDVN蛋白磷酸化位點預(yù)測

2.4 CDV N蛋白親疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)分析 利用DNAMAN對CDV N蛋白氨基酸序列進(jìn)行親疏水性分析，結(jié)果顯示該蛋白親水性及疏水性主要分布區(qū)間為-4～4，親水氨基酸明顯多于疏水氨基酸，占據(jù)了該蛋白的主要成分（見圖5-A）?？缒し治鼋Y(jié)果顯示（見圖5-B），N蛋白存在4個跨膜片段，跨膜區(qū)域分別為：第29-52aa，多肽長度為24aa；第66-85aa，多肽長度為20aa；第172-196aa，長度為25aa；第249-277aa，長度為29aa。

圖5 CDV N蛋白疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)分析

2.5 CDV N蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示（見圖6），CDV N蛋白氨基酸序列由α-螺旋結(jié)構(gòu)、β-折疊和隨機(jī)卷曲三種結(jié)構(gòu)組成。其中α-螺旋結(jié)構(gòu)占比為33.84%，β-折疊占16.44%，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占49.72%。

圖6 CDV N蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.6 CDV N蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 在SWIS-MODEL數(shù)據(jù)庫中匹配到CDV N蛋白的模板（見圖7-A），CDV N蛋白與模型蛋白的同源性為54%（見圖7-B），N蛋白的QMEAN為-1.69（見圖7-C）。CDV N蛋白氨基酸與模型氨基酸的對應(yīng)序列見圖7-D，從建模結(jié)果得知CDV N蛋白的三維結(jié)構(gòu)與預(yù)測結(jié)果基本一致。

圖7 CDV N蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.7 CDV N蛋白抗原位點分析 利用DNAMAN對CDV N蛋白進(jìn)行抗原位點分析，結(jié)果顯示該蛋白共含有22個抗原位點，最大分值為1.225（見表2）。

表2 CDV N蛋白抗原位點分析

3 討論

生物信息學(xué)分析是利用計算機(jī)對基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，是現(xiàn)代分子生物學(xué)重要的研究方法之一。CDV N基因編碼的N蛋白具有良好免疫原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫。N基因同源性分析發(fā)現(xiàn)。經(jīng)親疏水性預(yù)測，發(fā)現(xiàn)N蛋白親水作用較強(qiáng)，因此推測該蛋白可溶于水中。蛋白質(zhì)磷酸化修飾與DNA損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程相關(guān)，通過研究蛋白質(zhì)磷酸化可闡述多種生物學(xué)過程機(jī)理[8]。磷酸化主要指肽鏈中有絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸的側(cè)鏈被修飾，經(jīng)過生物學(xué)軟件分析可知N蛋白存在32個絲氨酸位點，15個蘇氨酸位點，5個酪氨酸位點，為今后研究該蛋白的相關(guān)生物學(xué)過程機(jī)理奠定前期基礎(chǔ)。糖基化能改變多肽構(gòu)象，因而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[9]。對N蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白不存在糖基化位點，無糖基化位點對該蛋白穩(wěn)定的影響還有待進(jìn)一步研究。通過對N蛋白的跨膜域分析顯示存在4個跨膜域，推測該蛋白有可能作為膜受體起作用或離子通道蛋白。蛋白質(zhì)不同的二級、三級結(jié)構(gòu)對其功能起著至關(guān)重要作用，通過對N蛋白分析發(fā)現(xiàn)該蛋白二級結(jié)構(gòu)主要是由無規(guī)則卷曲構(gòu)成，并在數(shù)據(jù)庫中找到與該蛋白相似的模型結(jié)構(gòu)。抗原肽一般指具有免疫原性的多肽或抗原衍生肽，對動物免疫功能具有重要意義[10-11]。經(jīng)分析，CDV N蛋白有22個抗原位點，具有豐富的抗原位點，為今后多抗原表位篩選做好前期工作基礎(chǔ)。

本研究通過對CDV N基因進(jìn)行生物學(xué)分析，為進(jìn)一步對CDV N相關(guān)功能及機(jī)理的闡釋及研究提供前期理論基礎(chǔ)。