華 珍 武夷山市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 福建武夷山 354300

近來年，國內(nèi)豬場對豬病的防控意識逐漸提高，但仔豬腹瀉仍是威脅我國生豬養(yǎng)殖發(fā)展的主要疾病之一，且每年因仔豬腹瀉死亡所造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。在生豬飼養(yǎng)中，引起仔豬腹瀉的病毒性病原種類繁多，包括豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬德塔冠狀病毒（PDcoV）和豬輪狀病毒（PRoV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）和豬細(xì)小病毒（PPV）等，以上病原感染仔豬所導(dǎo)致的臨床癥狀及病理變化較為相似，使用傳統(tǒng)臨床診斷方法無法確診，繼而延誤疾病防治[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，以PCR/RT-PCR技術(shù)為核心的檢測方法廣泛應(yīng)用于豬場病原的快速診斷，這為疾病的防控提供了便捷的技術(shù)手段。

2020年11月初，福建省南平地區(qū)某養(yǎng)殖場仔豬暴發(fā)腹瀉，筆者根據(jù)發(fā)病仔豬臨床癥狀特點(diǎn)，采集其小腸組織樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查，結(jié)果該場暴發(fā)的腹瀉是由PEDV變異株引起，現(xiàn)將具體診斷過程報道如下。

1 材料與方法

1.1 病例情況 福建南平某豬場飼養(yǎng)繁殖母豬40余頭，該場于2020年11月初，部分欄舍仔豬開始腹瀉，其后豬場飼養(yǎng)員給腹瀉仔豬灌服抗生素，但效果不佳。至11月7日，該場已有80余頭仔豬發(fā)病，死亡42頭。據(jù)養(yǎng)殖戶介紹，發(fā)病豬群典型臨床癥狀即為急性腹瀉，且部分仔豬嘔吐，導(dǎo)致患豬死亡的大部分原因是嚴(yán)重脫水。為確診，采集發(fā)病嚴(yán)重的仔豬小腸、腹股溝淋巴結(jié)送至生豬疫病檢測中心進(jìn)行病原診斷。

1.2 主要材料 DNA/RNA核酸提取試劑盒購自北京生化科技有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；Taq PCR Mix預(yù)混液、DL 2000 marker和瓊脂糖粉末等均購自于上海生物工程科技公司。

1.3 方法

1.3.1 病料處理與核酸提取 用滅菌刀將小腸和淋巴結(jié)組織切碎后，取0.2 g組織與1 mL生理鹽水混合，高速勻漿后離心，取200 uL上清根據(jù)DNA/RNA提取試劑盒說明書提取樣本核酸，將核酸中RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA樣品保存于-80℃待檢。

1.3.2 病原檢測 應(yīng)用商業(yè)化病原檢測試劑盒采用實(shí)時熒光定量PCR法分別檢測樣品中是否含有PEDV、TGEV、PRoV、PDcoV、PRV、PPV和PCV2，根據(jù)樣品CT值判定其是否為對應(yīng)病原陰、陽性。

1.3.3 PEDV S1基因序列擴(kuò)增及分析 用一對特異性引物擴(kuò)增PEDV S1基因序列，其中RT-PCR體系（50 uL）中包含2×PCR mix預(yù)混液25 uL、上下游引物（10 pmoL/L）各2 uL、模板cDNA 3 uL及雙蒸水18 uL，反應(yīng)條件為94℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃2 min，共35個循環(huán)，72℃10 min，其后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，并切膠回收后送至生物公司進(jìn)行雙向測序。將返回序列進(jìn)行拼接后，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST，比較該序列與GenBank上收錄的不同PEDV毒株對應(yīng)序列的同源性，確定獲得毒株所屬的基因型。

2 結(jié) 果

2.1 病原檢測結(jié)果 使用商業(yè)化試劑盒分別檢測可能導(dǎo)致仔豬腹瀉的病毒性病原，結(jié)果僅從發(fā)病豬組織樣品中檢測出PEDV核酸。此外，我們對樣品處理后接種在普通瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，未發(fā)現(xiàn)任何菌落生長，提示該場仔豬腹瀉是由PEDV感染引起。

2.2 PEDV S1基因擴(kuò)增凝膠電泳結(jié)果 使用一對特異性引物應(yīng)用PCR法擴(kuò)增PEDV S1基因序列，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果見圖1，擴(kuò)增序列大小約為1900 bp左右，與預(yù)期大小基本一致，且無非特異性條帶，提示擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為PEDV S1基因序列。

圖1 PEDV S1基因序列擴(kuò)增PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.3 PEDV S1基因序列變異情況分析 將PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行純化后送至生物公司進(jìn)行雙向測序，對返回序列進(jìn)行拼接，最終序列大小為1983 bp。核苷酸序列同源性分析結(jié)果（見圖2）發(fā)現(xiàn)，該毒株S1基因序列與GenBank收錄的PEDV中國流行變異株（KY624222.1和KY624212.1）同源性較高，均超過97.4%，但與PEDV疫苗株（JN599150.1）同源性相對較低，僅為92.2%。根據(jù)以上結(jié)果可判定該場此次暴發(fā)的腹瀉是由PEDV變異株引起。

圖2 PEDV分離株S1基因核苷酸序列同源性分析結(jié)果

3 討論

1）近年來，很多養(yǎng)殖場極大程度地提高了生物安全防控水平，這對疫病防控起到了積極作用。但仔豬腹瀉在豬場仍然較為常見，且導(dǎo)致仔豬腹瀉的病原較多，使用傳統(tǒng)的臨床診斷方法無法對此類病原進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，需依靠更加方便快捷的分子生物學(xué)方法。

2）PEDV在我國是導(dǎo)致仔豬腹瀉的主要病原之一，該病原為RNA病毒，屬冠狀病毒科，其基因組變異速率較快，給相應(yīng)的防控帶來巨大考驗(yàn)。在2010年后我國出現(xiàn)了PEDV變異株，與傳統(tǒng)毒株相比，變異株毒力更強(qiáng)，對我國養(yǎng)豬業(yè)危害也更大。在PEDV基因組中，S1基因變異速率相對較快，選擇以S1基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析可初步明確毒株基因型和變異情況[2-3]。

3）該文涉及到的案例為仔豬嚴(yán)重腹瀉，但傳統(tǒng)的臨床診斷無法對病原進(jìn)行確診，筆者采用分子生物學(xué)方法，最終確定為PEDV感染。由于PEDV分為疫苗株和變異株，這兩種毒株均可導(dǎo)致仔豬腹瀉，但基于疫苗株研發(fā)的疫苗對變異株的防控能力有限，故筆者通過擴(kuò)增與分析該毒株的S1基因變異情況，確定該毒株屬于變異株。對于豬流行性腹瀉的防控，養(yǎng)殖場可以按生物防控和疫苗接種模式進(jìn)行，其中生物防控包括定期消毒、減少飼養(yǎng)人員在豬舍間流動，同時提高飼養(yǎng)管理水平等；而疫苗接種主要是對豬群免疫接種PEDV相應(yīng)的弱毒苗或滅活疫苗。