梅彩月，馬沁春，王 燕,2，周艷陽(yáng)，李云赟，沈鵬程,2，王 晶,2，焦新安,2

早在20世紀(jì)50年代，黏菌素就一直被用于治療由革蘭氏陰性菌引起的感染，主要是多黏菌素B和多黏菌素E，到1970年前后因?yàn)轲ぞ鼐哂心I毒性和神經(jīng)毒性的副作用而被停止在臨床使用[1-2]。但在中國(guó)等多個(gè)國(guó)家，黏菌素被用作飼料添加劑在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用。20世紀(jì)90年代初，隨著多重耐藥革蘭氏陰性菌株的出現(xiàn)和新抗生素的缺乏，黏菌素開(kāi)始重新被應(yīng)用于臨床，成為治療碳青霉烯類耐藥腸桿菌的最后一道防線[3]，因此，世界衛(wèi)生組織(WHO)將其歸類為對(duì)人類醫(yī)學(xué)至關(guān)重要的藥物[4]。

過(guò)去認(rèn)為，革蘭氏陰性菌對(duì)多黏菌素耐藥的主要機(jī)制是通過(guò)正電荷的方式修飾脂質(zhì)A，如氨基阿拉伯糖或磷酸乙醇胺[5-6]。自2015 年我國(guó)在豬源大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的可水平轉(zhuǎn)移的多黏菌素耐藥基因，將其命名為mcr-1(Mobile Colistin Resistance, MCR)，隨后在全球各地引起研究mcr-1的熱潮[7]。mcr-1基因在食品動(dòng)物和動(dòng)物性食品中最為流行，也陸續(xù)在寵物、野生動(dòng)物、人、環(huán)境和蔬菜中發(fā)現(xiàn)[8]。目前，在中國(guó)、韓國(guó)、瑞士等國(guó)家中陸續(xù)在蔬菜中檢出mcr-1，檢出率較低(0.076%～3.6%)且大腸桿菌是mcr-1的主要宿主[9-12]?？缮呈卟擞锌赡鼙粷补嗟募S肥、水或土壤中耐藥細(xì)菌污染，并可能通過(guò)食物鏈將耐藥菌傳遞給人類，因此有必要對(duì)可生食蔬菜進(jìn)行耐藥菌的監(jiān)測(cè)。本研究對(duì)揚(yáng)州市可生食蔬菜進(jìn)行mcr-1基因的檢測(cè)，檢測(cè)到1株mcr-1陽(yáng)性大腸桿菌，對(duì)其耐藥特點(diǎn)和菌株特征進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 樣品來(lái)源 2019年11月在揚(yáng)州2家超市采集零售蔬菜樣品251份，包括黃瓜66份、西紅柿62份、胡蘿卜60份、生菜63份。

1.2 抗菌藥物 氨芐西林、頭孢唑啉購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，頭孢噻肟、氯霉素、氟苯尼考、多黏菌素購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，慶大霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，阿米卡星、美羅培南、磷霉素購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，鹽酸四環(huán)素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，萘啶酸、磺胺甲惡唑-甲氧芐啶購(gòu)自Sigma-Aldrich。

1.3 培養(yǎng)基 麥康凱瓊脂購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物有限公司，伊紅美蘭瓊脂購(gòu)自青島海博生物技術(shù)試劑有限公司，LB 瓊脂和LB 肉湯購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.4 細(xì)菌分離鑒定 在超凈工作臺(tái)中將采集到的蔬菜樣品接種于40～45 mL LB 肉湯試管中，生菜樣品接種于無(wú)菌采樣袋，37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h。使用麥康凱瓊脂進(jìn)行細(xì)菌純化，培養(yǎng) 16～18 h后，用接種環(huán)挑取粉色并且中間顏色深的單菌落于伊紅美藍(lán)瓊脂板上進(jìn)行二次純化，挑選具有金屬光澤疑似大腸桿菌，用30%甘油肉湯保存在-70 ℃，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.5 提取DNA模板 挑取麥康凱板上生長(zhǎng)的單菌落接種至LB瓊脂板上，繼續(xù)培養(yǎng)12～18 h，刮取適量菌苔，充分懸浮于含500 μL 1×TE Buffer的1.5 mL離心管中，100 ℃加熱15 min，冰浴15 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液移至另一支1.5 mL離心管，即制得模板DNA，將其放于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR檢測(cè)耐藥基因mcr-1引物序列參考相關(guān)文獻(xiàn)[13]進(jìn)行設(shè)計(jì)，由南京金斯瑞公司合成。采用 25 μL的 PCR 反應(yīng)體系，并設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，緩沖液為0.5×TBE，DL2000作為DNA分子量marker，120 V/cm電壓下電泳30 min后用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照分析。將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進(jìn)行比對(duì)。同時(shí)，利用16S rRNA基因擴(kuò)增和測(cè)序?qū)υ搈cr-1陽(yáng)性菌進(jìn)行菌種鑒定[14]。

1.7 藥物敏感性測(cè)定 對(duì)mcr-1陽(yáng)性大腸桿菌采用微量肉湯稀釋法測(cè)定對(duì)16種常用藥物的最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)，藥敏結(jié)果根據(jù)CLSI或EUCAST標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，大腸桿菌ATCC 25922為藥物敏感性測(cè)定的質(zhì)控菌株。

1.8 全基因組測(cè)序及分析 按照天根全基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取，將樣品送至北京諾禾致源生物有限公司進(jìn)行二代測(cè)序，通過(guò)軟件SPAdes 3.10.0進(jìn)行組裝，組裝好的全基因組數(shù)據(jù)利用 CGE 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cge.cbs.dtu.dk/)進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing, MLST)、耐藥基因、染色體位點(diǎn)突變以及質(zhì)粒分析。

2 結(jié) 果

2.1 大腸桿菌分離及mcr-1基因檢測(cè) 從251份蔬菜樣品中共分離獲得189株腸桿菌，包括麥康凱板分離的138株腸桿菌，和含2 mg/L 頭孢噻肟的麥康凱板分離的51株腸桿菌，僅在1株(0.53%)藥板分離的生菜來(lái)源的腸桿菌YZ19VCLC47中檢測(cè)到mcr-1基因，16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果證實(shí)其為大腸桿菌。

2.2mcr-1陽(yáng)性大腸桿菌特征 菌株YZ19VCLC47對(duì)黏菌素的MIC為8 mg/L，且對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢噻肟、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、氟苯尼考、奈啶酸、環(huán)丙沙星、磷霉素和復(fù)方新諾明耐藥。對(duì)該菌株全基因組序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株為ST359型大腸桿菌，除攜帶mcr-1外，還同時(shí)攜帶多種耐藥基因，如blaTEM-1b等，詳見(jiàn)表1。同時(shí)菌株還存在喹諾酮耐藥相關(guān)染色體基因gyrA和parC的突變，與oqxAB共同作用導(dǎo)致其對(duì)環(huán)丙沙星耐藥。菌株YZ19VCLC47攜帶IncI1、IncI2和F18:A-:B1質(zhì)粒，其中mcr-1位于IncI2質(zhì)粒上。

表1 1株mcr-1陽(yáng)性多重耐藥大腸桿菌的菌株特征

2.3 質(zhì)粒分析 對(duì)大腸桿菌YZ19VCLC47攜帶的mcr-1質(zhì)粒pYUYZV47-MCR(GenBank收錄號(hào)MW373507)與不同地區(qū)、來(lái)源和菌種的mcr-1陽(yáng)性IncI2質(zhì)粒序列進(jìn)行比較分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)pYUYZV47-MCR具有典型的IncI2骨架結(jié)構(gòu)，包括復(fù)制區(qū)、接合先導(dǎo)區(qū)和接合轉(zhuǎn)移區(qū)，與全球流行的mcr-1陽(yáng)性IncI2質(zhì)粒序列高度相似。pYUYZV47-MCR與首次發(fā)現(xiàn)攜帶mcr-1的質(zhì)粒pHNSHP45相似性高達(dá)99.6%，覆蓋率達(dá)89%。不同的是，質(zhì)粒pYUYZV47-MCR中mcr-1基因上游無(wú)ISApl1的插入，并缺少包含IS683轉(zhuǎn)座酶基因tnpA和stbD/stbE的片段。

圖2 pYUYZV47-mcr與mcr-1陽(yáng)性IncI2質(zhì)粒比較

3 討 論

自2015年首次在豬源大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)mcr-1基因后，該基因陸續(xù)在全球食品動(dòng)物、寵物、野生動(dòng)物、人、環(huán)境、蔬菜、動(dòng)物性食品等多種來(lái)源腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，其中mcr-1在食品動(dòng)物和動(dòng)物性食品中檢出率較高，可能與黏菌素作為飼料添加劑在養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用有關(guān)[8,15]。mcr-1在蔬菜中的檢出率顯著低于動(dòng)物中的檢出率[4]。本研究中，mcr-1在蔬菜源中的檢出率只有0.53%，低于國(guó)外和我國(guó)其他地區(qū)蔬菜中mcr-1的檢出率[9-10,12]。在瑞士Zurfuh等[9]從進(jìn)口蔬菜中分離到2株(3.33%)攜帶mcr-1的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended spectrum β-lactamases, ESBLs)大腸桿菌。在我國(guó)，Luo等[10]對(duì)廣州2015—2016年間采集的708份市售蔬菜樣品進(jìn)行mcr-1的檢測(cè)，結(jié)果150株大腸桿菌中有3株(2%)攜帶mcr-1，202株產(chǎn)ESBLs腸桿菌中6株(2.97%)檢測(cè)到mcr-1基因，包括4株大腸桿菌和2株拉馬爾菌。

本研究中檢測(cè)到的1株mcr-1陽(yáng)性大腸桿菌YZ19VCLC47，多序列位點(diǎn)分型結(jié)果為ST359型。ST359大腸桿菌是目前流行的產(chǎn)ESBLs克隆型之一[16]，此外ST359型大腸桿菌主要分離自動(dòng)物和零售雞肉(火雞、產(chǎn)蛋雞、老母雞)樣品[16-20]，且與分離自人類樣品的具有高度相似性[20]，說(shuō)明ST359菌株具有人獸共患病潛能，我們?cè)谑卟酥邪l(fā)現(xiàn)ST359型大腸桿菌，提示有可能是通過(guò)動(dòng)物糞肥傳遞到蔬菜中，而可生食蔬菜若未清洗干凈，病原菌可通過(guò)食物鏈傳播給人類。目前已陸續(xù)在豬肉、雞肉、牛肉、蔬菜、水等不同樣品中檢出mcr-1[4]，且mcr-1已在不同菌種間傳播，可能是因?yàn)閙cr-1主要存在于可接合質(zhì)粒中，使得mcr-1基因可以在不同宿主間快速傳播。本研究中大腸桿菌YZ19VCLC47的mcr-1位于IncI2質(zhì)粒pYUYZV47-MCR上，并且與不同來(lái)源、菌種和地區(qū)攜帶mcr-1的IncI2質(zhì)粒高度相似。除IncI2質(zhì)粒外，IncX4和IncHI2質(zhì)粒也是mcr-1在全球傳播的主要載體[21]。可移動(dòng)元件ISApl1常介導(dǎo)mcr-1的轉(zhuǎn)移，幫助mcr-1在不同質(zhì)粒之間以及質(zhì)粒與染色體之間轉(zhuǎn)移，然而本研究中并未在mcr-1的上游或下游發(fā)現(xiàn)ISApl1，可能是在進(jìn)化或傳播過(guò)程中丟失ISApl1以保證基因的穩(wěn)定性[22]。此外，該mcr-1陽(yáng)性菌株還同時(shí)攜帶多種耐藥基因，如β-內(nèi)酰胺酶基因(blaCTX-M-14)、磷霉素耐藥基因(fosA3)、氟苯尼考耐藥基因(floR)、喹諾酮耐藥基因(oqxAB)等，導(dǎo)致其對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢噻肟、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、氟苯尼考、萘啶酸、環(huán)丙沙星、磷霉素和復(fù)方新諾明耐藥。雖然黏菌素禁止作為飼料添加劑在動(dòng)物飼料中使用[23]，可能會(huì)減緩黏菌素的傳播[24]，但頭孢菌素、氟苯尼考等其他藥物在養(yǎng)殖中的使用可能對(duì)mcr-1存在共選擇作用。

雖然mcr-1在蔬菜沾染細(xì)菌中檢出率較低，但可生食蔬菜可通過(guò)動(dòng)物糞便、土壤、水等途徑獲得耐藥菌，并由食物鏈傳播給人類，威脅人類健康，因此需要加強(qiáng)對(duì)蔬菜中耐藥菌的監(jiān)測(cè)。

利益沖突：無(wú)