趙 敬，楊漢蕾，陳素素，牟 榮

微小膜殼絳蟲(chóng)(Hymenolepisnana)是一種人獸共患寄生蟲(chóng)，主要寄生于人及嚙齒類(lèi)動(dòng)物的腸道。我國(guó)主要分布在17個(gè)省市和自治區(qū)，其中新疆維吾爾自治區(qū)的感染率最高[1]。近年來(lái)，在貧困地區(qū)和兒童中微小膜殼絳蟲(chóng)的感染更是帶來(lái)了很多流行病和公共衛(wèi)生的新興問(wèn)題[2]。目前微小膜殼絳蟲(chóng)在流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)及治療方面的研究比較常見(jiàn)，但在免疫方面的研究并不多見(jiàn)。

LY6家族可參與T細(xì)胞活化[3-4]、嗅覺(jué)[5]和細(xì)胞粘附[6]等多種功能。其中LY6A(Lymphocyte antigen 6 complex locus A)又叫作Sca-1(Stem cell antigen-1)，它是LY6基因家族中第1個(gè)被鑒定的成員，也是一種糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定細(xì)胞表面蛋白。其廣泛表達(dá)于不同的細(xì)胞類(lèi)型，包括造血干細(xì)胞、大多數(shù)淋巴細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、單核細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞[7-10]。研究發(fā)現(xiàn)LY6A(Sca-1)的表達(dá)對(duì)與炎癥性腸病(IBD)免疫發(fā)病機(jī)制有關(guān)的趨化因子分泌產(chǎn)生影響[11]。此外，γ-干擾素(IFN-γ)等細(xì)胞因子可以廣泛促進(jìn)LY6A(Sca-1)的表達(dá)，并且細(xì)胞因子介導(dǎo)的LY6A(Sca-1)的誘導(dǎo)依賴(lài)于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(Signal transducerand activator of transcription 1，STAT1)[12]。近年來(lái)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)LY6A在多形螺旋線蟲(chóng)感染的小鼠小腸肉芽腫中表達(dá)升高[13]。但是目前尚無(wú)微小膜殼絳蟲(chóng)感染后小腸組織中LY6A(Sca-1)及IFN-γ、STAT1表達(dá)的研究報(bào)道。因此本研究在建立微小膜殼絳蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)感染ICR小鼠動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，對(duì)感染后第2 d和第8 d的小鼠小腸采用HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)LY6A、IFN-γ和STAT1的mRNA相對(duì)表達(dá)量，免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)小腸中LY6A(Sca-1)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比，并用PRM技術(shù)對(duì)LY6A(Sca-1)蛋白和STAT1蛋白的相對(duì)豐度進(jìn)行定量，以探討微小膜殼絳蟲(chóng)感染小鼠小腸組織中LY6A(Sca-1)、IFN-γ和STAT1表達(dá)情況，為深入研究微小膜殼絳蟲(chóng)所致宿主腸道免疫病理?yè)p傷的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 蟲(chóng)體來(lái)源 微小膜殼絳蟲(chóng)標(biāo)本采自貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)野生小鼠，前期課題組經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定采集蟲(chóng)體為微小膜殼絳蟲(chóng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 120只4～6周齡ICR小鼠購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)，體重約26 g，體健，經(jīng)糞檢證實(shí)無(wú)寄生蟲(chóng)感染。

1.1.3 主要試劑和儀器 主要試劑Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自日本TAKARA 公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，二甲苯、無(wú)水乙醇、4%多聚甲醛、蘇木素、伊紅均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，兔抗鼠LY6A/Sca-1單克隆抗體(ab109211)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，通用二步法試劑盒、封閉用羊血清、DAB顯色試劑和檸檬酸鹽修復(fù)液均購(gòu)自北京中杉金橋公司。主要儀器熒光定量PCR儀(7300)為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品，輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)及成像系統(tǒng)均為德國(guó)公司產(chǎn)品，型號(hào)分別為L(zhǎng)eica RM2255和Leica DM6B。

1.2 方 法

1.2.1 蟲(chóng)卵收集和計(jì)數(shù) 將微小膜殼絳蟲(chóng)的末段孕節(jié)放在盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中用注射器針頭沿縱軸劃破孕節(jié)使蟲(chóng)卵溢出，并用生理鹽水反復(fù)清洗，2 000 r/min離心10 min，收集蟲(chóng)卵備用。使用光學(xué)顯微鏡觀察收集的蟲(chóng)卵并反復(fù)計(jì)數(shù)5次，取平均值，定量300 μL生理鹽水中蟲(chóng)卵數(shù)為1 000個(gè)備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染和標(biāo)本采集 將ICR小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各6只，實(shí)驗(yàn)組以定量1 000個(gè)/只蟲(chóng)卵通過(guò)灌胃感染。于感染后第2 d和第8 d按照編號(hào)處死實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠各6只，采集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組腸組織，隨機(jī)取3只小鼠距回盲部6～8 cm的小腸放入盛有1 mL的EP管內(nèi)液氮速凍后再置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ａ硗?只小鼠取小腸相同部位放入4%多聚甲醛中固定后保存。

1.2.3 小腸組織病理學(xué)觀察 小腸組織固定后經(jīng)脫水、包埋、切片，切片厚度為4 μm，然后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，H&E stain)。連續(xù)切片并選擇染色良好的腸管橫切面，在顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用上海生工公司在線軟件設(shè)計(jì)并合成LY6A(Sca-1)、IFN-γ、STAT1和3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物，并由其合成(表 1)。使用Trizol法提取各組小腸組織總RNA，按照試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。將實(shí)時(shí)熒光定量PCR得出的各組LY6A(Sca-1)、IFN-γ、STAT1和內(nèi)參基因GAPDH的CT值記錄下來(lái)，重復(fù)3次取平均值。計(jì)算LY6A(Sca-1)、IFN-γ和STAT1的△△CT值，采用2-△△CT法計(jì)算出各組LY6A(Sca-1)、IFN-γ和STAT1的相對(duì)表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR引物

1.2.5 免疫組織化學(xué) 常規(guī)制作石蠟切片，厚度為3 μm，并進(jìn)行脫蠟、脫水、過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、檸檬酸鹽修復(fù)，然后加入一抗LY6A(1∶50)4 ℃孵育過(guò)夜。復(fù)溫30 min，再加入二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色3 min，蘇木素復(fù)染10 s，中性樹(shù)膠封片后顯微鏡下觀察。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

結(jié)果判定：陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)棕黃色著色。每張組織切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，觀察陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比[14]。

1.2.6 PRM技術(shù)檢測(cè) 樣品從-80 ℃取出，稱(chēng)取適量組織樣品至液氮預(yù)冷的研缽中，加液氮充分研磨至粉末提取動(dòng)物總蛋白，并利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。將蛋白進(jìn)行胰酶酶解，肽段使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。最后采用所選肽段的碎片離子峰面積對(duì)LY6A和STAT1蛋白的相對(duì)豐度進(jìn)行定量[15]。

2 結(jié) 果

2.1 微小膜殼絳蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)感染ICR小鼠結(jié)果 ICR小鼠可以感染微小膜殼絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵，自感染后第7 d開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)組小鼠在距回盲部6～12 cm處可見(jiàn)白色蟲(chóng)體(圖1)，檢獲率100%。

圖1 小鼠小腸感染后獲取的微小膜殼絳蟲(chóng)

2.2 小腸組織病理觀察結(jié)果 感染后第2 d，HE染色連續(xù)切片顯示小腸組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯病理變化(圖2A)。感染第8 d，小腸腸腔內(nèi)可見(jiàn)成蟲(chóng)節(jié)片，且成蟲(chóng)寄生部位嗜酸性粒細(xì)胞明顯增多(圖2B)。

A:感染后第2 d小鼠腸組織HE染色結(jié)果；B:感染后第8 d小鼠腸組織HE染色結(jié)果，↑示成蟲(chóng)節(jié)片。(放大倍數(shù)=100倍)

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LY6A(Sca-1)、IFN-γ和STAT1的mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果 感染后第2 d，實(shí)驗(yàn)組LY6A的mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.57,P<0.001)；感染后第8 d實(shí)驗(yàn)組LY6A的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.01,P<0.001)(圖3A)。感染后第2 d，實(shí)驗(yàn)組IFN-γ的mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.78,P<0.01)；感染后第8 d，實(shí)驗(yàn)組IFN-γ的mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=26.47,P<0.001)(圖3B)。在感染后第2 d，實(shí)驗(yàn)組STAT1的mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.13,P<0.001)；而在感染后第8 d實(shí)驗(yàn)組STAT1的表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.19,P<0.001)(圖3C)。

注：①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001

2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)小腸LY6A蛋白表達(dá)結(jié)果 顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組腸組織LY6A蛋白染色均可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞,陽(yáng)性細(xì)胞主要出現(xiàn)在小腸間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)上(圖4A-D)。感染后第2 d實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性細(xì)胞百分比高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.26,P<0.01)；感染后第8 d實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.18,P<0.001)(圖5)。

A:第2 d對(duì)照組小鼠腸組織LY6A蛋白免疫組化結(jié)果；B:感染后第2 d實(shí)驗(yàn)組小鼠腸組織LY6A蛋白免疫組化結(jié)果；C：第8 d對(duì)照組小鼠腸組織LY6A蛋白免疫組化結(jié)果；D:感染后第8 d實(shí)驗(yàn)組小鼠腸組織LY6A蛋白免疫組化結(jié)果。(A-D放大倍數(shù)為200倍)

注：①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001

2.5 PRM檢測(cè)小腸LY6A和STAT1蛋白表達(dá)結(jié)果 感染后第2 d實(shí)驗(yàn)組LY6A蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.55,P<0.05)；而感染后第8 d實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比LY6A蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.95,P<0.05)(圖6A)。感染后第2 d STAT1蛋白實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在感染后第8 d實(shí)驗(yàn)組STAT1蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.91,P<0.05)(圖6B)。

注：①P<0.05

3 討 論

T細(xì)胞可介導(dǎo)很多與寄生蟲(chóng)感染免疫相關(guān)的反應(yīng)[16]。目前研究已證實(shí)輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)可通過(guò)分泌細(xì)胞因子介導(dǎo)宿主抗微小膜殼絳蟲(chóng)感染的保護(hù)性免疫[1]。IFN-γ作為T(mén)h1型細(xì)胞主要分泌的細(xì)胞因子，在先天性免疫和適應(yīng)性免疫中都發(fā)揮了重要作用[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)旋毛蟲(chóng)感染小鼠的第3 d和第6 d，IFN-γ和Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)明顯升高，呈現(xiàn)出Th1/Th2混合型免疫應(yīng)答[19]。Toenjes研究肥頭絳蟲(chóng)(Taeniacrassiceps)感染BALB/c小鼠的第3 d、第5 d和第7 d，腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)感染早期IFN-γ增加，隨后IFN-γ的表達(dá)水平下降，IL-10快速增加[20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)微小膜殼絳蟲(chóng)感染第2 d實(shí)驗(yàn)組IFN-γ的mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，目前已知微小膜殼絳蟲(chóng)感染小鼠后其蟲(chóng)卵在小腸內(nèi)經(jīng)消化液的刺激，六鉤蚴破殼而出，鉆進(jìn)腸絨毛，在腸絨毛中逐漸發(fā)育，經(jīng)3～4 d形成似囊尾蚴，據(jù)此推測(cè)微小膜殼絳蟲(chóng)感染后早期侵入的幼蟲(chóng)在腸絨毛內(nèi)的發(fā)育很可能激發(fā)了Th1型免疫應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在感染后第8 d，實(shí)驗(yàn)組IFN-γ的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，且小腸組織切片顯示腸腔內(nèi)含有成蟲(chóng)節(jié)片，考慮微小膜殼絳蟲(chóng)在腸腔發(fā)育為成蟲(chóng)時(shí)，宿主的Th1型免疫應(yīng)答已不占主導(dǎo)地位，但它是否激發(fā)了宿主的Th2型免疫應(yīng)答，還有待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞因子IFN-γ被認(rèn)為與促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中Sca-1(LY6A)的表達(dá)有關(guān)[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)微小膜殼絳蟲(chóng)感染小鼠后第8 d蟲(chóng)體寄生處小腸黏膜出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為嗜酸性粒細(xì)胞明顯增多，而且LY6A的表達(dá)水平高于對(duì)照組，IFN-γ的表達(dá)水平卻下降。但是有研究報(bào)道LY6A(Sca-1)的RNA表達(dá)水平在結(jié)腸炎小鼠的腸道上皮細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，同時(shí)IFN-γ的表達(dá)也升高[11]。這與我們的研究結(jié)果有矛盾之處，可能反映了內(nèi)源性IFN-γ在系統(tǒng)感染中作用的復(fù)雜性，因?yàn)樵谙到y(tǒng)性感染中，T細(xì)胞抗原受體(TCR)和其他細(xì)胞因子都容易促進(jìn)LY6A(Sca-1)的表達(dá)[12]。弓形蟲(chóng)病中 IFN-γ作為關(guān)鍵細(xì)胞因子誘導(dǎo)LY6A(Sca-1)的表達(dá)，但使用抗IFN-γ抗體處理弓形蟲(chóng)感染后的小鼠發(fā)現(xiàn)IFN-γ的阻斷反而增加了LY6A(Sca-1)的表達(dá)，可見(jiàn)LY6A(Sca-1)的表達(dá)并未因IFN-γ的缺乏而下降，這可能是由于IFN-γ的缺乏導(dǎo)致寄生蟲(chóng)復(fù)制和抗原負(fù)荷顯著增加，從而導(dǎo)致了T細(xì)胞活化增加[12]。據(jù)此我們推測(cè)微小膜殼絳蟲(chóng)感染小鼠后小腸的免疫病理變化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，IFN-γ對(duì)小鼠小腸LY6A的表達(dá)并不起關(guān)鍵作用，LY6A的表達(dá)是否受其他因子的調(diào)控尚有待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞因子所介導(dǎo)的信號(hào)通路中有幾個(gè)共同要素可以最有力地誘導(dǎo)Sca-1(LY6A)的表達(dá)，特別是激活STAT1和上調(diào)T盒子轉(zhuǎn)錄因子(T-bet)表達(dá)的能力[23-25]。研究發(fā)現(xiàn)STAT1在IFN-γ介導(dǎo)的Sca-1(LY6A)誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用[12]。本研究結(jié)果顯示感染后第2 d實(shí)驗(yàn)組STAT1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量均低于對(duì)照組，而感染后第8 d實(shí)驗(yàn)組STAT1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，因此推測(cè)微小膜殼絳蟲(chóng)感染可激活STAT1的表達(dá)，從而在Sca-1(LY6A)的誘導(dǎo)中起作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)微小膜殼絳蟲(chóng)感染ICR小鼠小腸后LY6A(Sca-1)的mRNA水平和蛋白水平在幼蟲(chóng)侵入早期呈低表達(dá)，成蟲(chóng)期呈高表達(dá)；IFN-γ對(duì)LY6A的表達(dá)不起主導(dǎo)作用，STAT1可能對(duì)LY6A(Sca-1)的表達(dá)起誘導(dǎo)作用。今后可進(jìn)一步檢測(cè)其他細(xì)胞因子如Ⅰ IFN和IL-27對(duì)微小膜殼絳蟲(chóng)感染小鼠小腸LY6A(Sca-1)表達(dá)的影響，并進(jìn)一步研究LY6A(Sca-1)在促進(jìn)T細(xì)胞活化和遷移中的具體機(jī)制。

利益沖突：無(wú)