穆 慧，段 然，秦 帥，肖 萌，賀兆鍇，呂東月，湯德銘，楊晉川，景懷琦，詹 軍，王 鑫

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是一種重要的人獸共患腸道病原菌，人類感染主要導(dǎo)致急性胃腸炎、腸系膜淋巴結(jié)炎等偽闌尾炎癥狀，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎或結(jié)節(jié)性紅斑等后遺癥[1]。根據(jù)是否攜帶染色體的粘附侵襲基因(ail)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌耐熱性腸毒素A基因(ystA)以及毒力質(zhì)粒上的粘附素基因(yadA)、yop調(diào)節(jié)子的轉(zhuǎn)錄活化因子(virF)，可分為致病性菌株與非致病性菌株[2-3]。致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌與生物1B、2、3、4、5型有密切關(guān)系，其中1B被認(rèn)為是高致病性，生物2-5型為低致病菌[4]。ail基因通常存在于致病性菌株中，但近年來越來越多的研究在生物1A型菌株中檢測(cè)到該基因[5-6]。國(guó)內(nèi)學(xué)者黃瑛等人[6]報(bào)道了ail基因的不同序列型A1型-A3型：A1型與A3型存在于低致病菌與部分生物1A型菌株，A2型存在于高致病菌。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌最早在美國(guó)紐約被報(bào)道，此后在世界各國(guó)均有發(fā)現(xiàn)，是歐洲某些國(guó)家腹瀉的主要病原菌[7]。我國(guó)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分布廣泛[8-9]，在中國(guó)的家畜家禽和野生動(dòng)物等中均有分離，曾引起兩次大流行，造成數(shù)百人感染[10]。為了解我國(guó)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的流行分布情況，本研究對(duì)從腹瀉患者、動(dòng)物、食品和環(huán)境標(biāo)本來源的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行病原學(xué)和脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分子型別特征分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 依托國(guó)家科技部重大專項(xiàng)與全國(guó)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病原學(xué)監(jiān)測(cè)工作，自1980-2019年中國(guó)22個(gè)省市自治區(qū)，來源于腹瀉病人、家畜家禽、野生動(dòng)物、食品及外環(huán)境的標(biāo)本分離獲得6 847株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。少部分菌株由福建省疾病預(yù)防控制中心于恩庶教授惠贈(zèng)。

1.2 生化表型、血清型、生物型與毒力基因鑒定 對(duì)分離到的菌株使用梅里埃Api-20E進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定，對(duì)鑒定為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的菌株進(jìn)行血清型及生物分型，5種(ail、ystA、ystB、yadA、virF)毒力基因的普通PCR檢測(cè)[11]，生物型分型方法參照文獻(xiàn)[12]。采用玻片凝集法進(jìn)行血清分型，分型血清分別來自日本生研株式會(huì)社分型血清(O∶3、O∶5、O∶8、O∶9),丹麥SSI診斷血清(O∶3、O∶5、O∶8、O∶9)，本研究組研制的單克隆抗體(O∶3、O∶8、O∶9)及中國(guó)生物制品檢定所(現(xiàn)更名為：中國(guó)食品藥品檢定研究院)分型血清產(chǎn)品(其他血清型)。自中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心購(gòu)買的國(guó)際參考菌株52203、52211、52212分別用于O∶3、O∶8、O∶9血清型參比。對(duì)部分菌株進(jìn)行ail基因測(cè)序，與NCBI參考序列構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹(Mega 5.0)。

1.3 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型 參考中國(guó)疾病預(yù)防控制中心Pulse Net實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，使用NotI進(jìn)行酶切；電泳脈沖時(shí)間：2～20 s；電泳時(shí)間：19 h。具體操作步驟見文獻(xiàn)[13]。采用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(unweighted pair group average method，UPGMA)進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建聚類樹。

2 結(jié) 果

2.1 來源分布 6 847株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌主要來源于動(dòng)物(88.36%，6 050/6 847)，其次是腹瀉病人(6.44%，441/6 847)、食品(4.76%, 326/6 847)及外環(huán)境(0.44%, 30/6 847)。在動(dòng)物源菌株中，家畜以豬源株占比最高(38.21%，2 616/6 847)，野生動(dòng)物中，嚙齒類相對(duì)較高(24.46%，1 675/6 847)(表1)。

2.2 生物血清型分布 2 047株致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌僅存在O∶3和O∶9兩種血清型，其中O∶3血清型以3/O∶3(87.79%，1 797/2 047)為主，其次為4/O∶3(1.07%,22/2 047)、5/O∶3(0.10%, 2/2 047)型；O∶9血清型以2/O∶9型為主(10.45%，214/2 047)，其次為3/O∶9型(0.59%, 12/2 047)。非致病菌4 800株,以生物1A為主(91.4%, 4 387/4 800),生物型2型、3型、4型、5型共計(jì)413株(8.6%，413/4 800)，血清型眾多、占比前5位的O∶8、O∶5、O∶3、O∶6、O∶9依次為10%(480/4 800)9.7%(466/4 800)、5.6%(269/4 800)、1.8%(88/4 800)、1.5%(70/4 800)。

2.3 毒力基因分布 如表1所示，致病株共有兩種組合，其中I型占92.67%(1 897/2 047)，攜帶ail、ystA、yadA和virF基因，II型占7.33%(150/2 047)，為丟失毒力質(zhì)粒的致病菌。非致病株以攜帶ystB基因的III型和所有毒力基因均不攜帶的IV型占比較高，分別占62.83%(3 016/4 800)、36.19%(1 737/4 800)。上述4種典型的基因型別(I、II、III、IV)在所有調(diào)查的22個(gè)省份多有分布。此外，非致病株還存在僅攜帶ail基因(VI型)或同時(shí)攜帶ail和ystB基因(V型)的菌株分布于個(gè)別省份。對(duì)這兩類菌株的ail進(jìn)行CDS測(cè)序，并與NCBI中的參考序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示VI型[14]菌株的ail基因與已發(fā)表的A1序列型相同，V型菌株ail基因與既往發(fā)表的A1、A2、A3型序列均不相同[6]，為新的ail序列型。

表1 不同來源小腸結(jié)腸炎耶爾森菌毒力基因分布

2.4 地域分布特征 本研究自22個(gè)省市自治區(qū)分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，其中非致病菌在22個(gè)省份均有分布，致病菌分布19個(gè)省市自治區(qū)、分別位于華東(江蘇、浙江、安徽、山東、上海)、華北(北京、天津、內(nèi)蒙古)、西北(青海、寧夏)、西南(四川、貴州、云南)、東北(吉林、黑龍江)華南(福建、廣西)、華中(江西、河南)。不同省份致病性菌株的優(yōu)勢(shì)血清型存在不同，18個(gè)省市自治區(qū)以O(shè)∶3血清型為主，寧夏以O(shè)∶9血清型略占優(yōu)勢(shì)。

2.5 生化反應(yīng) 系統(tǒng)生化結(jié)果顯示致病株與非致病株的主要生化編碼不存在交叉，如致病株的主要生化編碼1014522、1014520、1015523等未見于非致病株的主要生化編碼，非致病株的主要生化編碼1155723、1155523、1114523未見于致病株的主要生化編碼(表3)。比較兩類菌株占比前10位的生化編碼發(fā)現(xiàn)，非致病菌普遍比致病性菌株具有更多的陽(yáng)性生化反應(yīng)。致病株中，O∶3血清型的主要生化編碼為1014522、1014520、1015523，O∶9血清型的主要生化編碼為1154523。

表2 致病性與非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在不同省市自治區(qū)的分布

表3 占比前10位的致病性、非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生化編碼

2.6 PFGE分型結(jié)果 依次分析O∶3血清型與O∶9血清型致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌PFGE型別。1 821株O∶3致病株酶切為93種帶型，占比前5的帶型依次為K6GN11C30021、K6GN11C30012、K6GN11C30068、K6GN11C30042、K6GN11C30058，分別占比46.35%(844/1 821)、22.5%(410/1 821)、4.89%(89/1 821)、4.23%(77/1 821)、1.65%(30/1 821)。優(yōu)勢(shì)帶型K6GN11C30021、K6GN11C30012地域分布最廣泛，分布于17個(gè)省市自治區(qū)，K6GN11C30012型別的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌宿主分布最廣泛，除了分布于腹瀉病人、家畜家禽及食品，嚙齒動(dòng)物和兔中也有分布且為這兩種宿主的優(yōu)勢(shì)帶型。對(duì)89株來源于腹瀉病人的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌菌株進(jìn)行分析，88.76%(79/89)的人源株與分離自動(dòng)物或食品的分離株共有20種相同的帶型；75.38%(67/89)人源菌株與當(dāng)?shù)氐膭?dòng)物或食品具有相同的帶型。其他人源株暫未發(fā)現(xiàn)與動(dòng)物及食品菌株一致的帶型。

226株O∶9血清型菌株分為14個(gè)帶型，占比前5的帶型依次為K6GN11C90008、K6GN11C90010、K6GN11C90018、K6GN11C90004、K6GN11C90003，分別占比26.11%(59/226)、23.89%(54/226)、21.24%(48/226)11.06%(25/226)、7.52%(17/226)，其中與人相關(guān)的帶型有5種(圖1)，3種帶型K6GN11C90003、K6GN11C90004、K6GN11C90008為人源菌株與當(dāng)?shù)貏?dòng)物或食品中菌株共有，涉及77.78%(7/9)人源菌株。

3 討 論

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是一種重要的人類腸道致病菌，本研究對(duì)6 847株菌進(jìn)行病原學(xué)與脈沖場(chǎng)凝膠電泳分子分型特征分析發(fā)現(xiàn)，我國(guó)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌地域分布廣泛，宿主眾多，在腹瀉病人、家畜家禽、及野生動(dòng)物中都有分布，眾所周知，豬為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的主要宿主[15-17]，農(nóng)家犬可能是我國(guó)致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌感染的重要來源[18-19]。農(nóng)家犬?dāng)y帶的致病性菌株比例較高、與腹瀉患者及豬分離株具有相似的帶型模式(圖2)，部分地區(qū)的犬分離株與腹瀉患者及豬分離株具有相同的PFGE帶型(圖1)，提示農(nóng)家犬與人類感染密切相關(guān)。既往研究表明致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分布具有地域差異，主要分布于北方寒冷地區(qū)[20]，本研究顯示分布于我國(guó)華東、華北、西北、西南、華南等地區(qū)均檢出致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，初步推測(cè)隨著時(shí)間的遷移，致病性菌株的分布可能已經(jīng)沒有明顯的地域差異，這可能與經(jīng)濟(jì)發(fā)展，各地區(qū)間交通貿(mào)易往來頻繁有關(guān)。

(紅色為人源株相關(guān)信息)

圖2 宿主來源占比前6位的O∶3血清型致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌PFGE帶型構(gòu)成(圖注僅包含前10種帶型)

不同國(guó)家地區(qū)的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生物血清型分布不同，歐洲、日本、加拿大等國(guó)家4/O∶3占主導(dǎo)地位[21-22]。本研究表明，中國(guó)致病性菌株僅存在于O∶3與O∶9血清型中，其中O∶3型菌株1 821株，O∶9型菌株226株，以3/O∶3型為主要生物血清型，其次為2/O∶9。3/O∶3型致病菌多分離自豬源株，而2/O∶9型致病菌主要分離自嚙齒類，提示不同宿主動(dòng)物可能對(duì)不同生物血清型菌株的易感性存在差異。生化結(jié)果顯示致病性菌株與非致病菌的主要生化編碼不存在交叉，非致病菌普遍比致病性菌株具有更多的陽(yáng)性生化反應(yīng)，表明其可能具有更強(qiáng)的生化代謝能力與環(huán)境適應(yīng)力。致病株中，O∶3血清型與O∶9血清型的主要生化編碼亦不存在交叉，表明二者可能具有不同的生化分解能力與生態(tài)位。

位于染色體上的ail、ystA基因和位于毒力質(zhì)粒上的yadA、virf基因決定了小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的致病性[23]，后者在人工傳代中容易丟失[3]。ail基因既往僅存在于致病菌中，但越來越多的研究在生物1A型菌株中發(fā)現(xiàn)該基因[24]，如德國(guó)的生豬肉，芬蘭病人與食品分離株[25-26]。國(guó)內(nèi)學(xué)者黃瑛等人[6]報(bào)道了致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中ail編碼序列(CDS)A1型-A3型：A1型存在于低致病菌與部分生物1A型菌株，A2型存在于的高致病菌、與A1型相比有21個(gè)堿基突變，A3型來自我國(guó)低致病菌，與A1型相比存在3個(gè)堿基突變。本研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)省份的非致病菌中存在ail基因，只攜帶ail基因的菌株與黃瑛等人[6]報(bào)道的A1序列型相同，同時(shí)攜帶ail、ystB基因的菌株與既往發(fā)表的A1、A2、A3等序列均不相同[6]，為新的ail序列型。

中國(guó)致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌PFGE型別多樣，不同地區(qū)的PFGE帶型既有共性，又有獨(dú)特性，提示小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的基因有一定的遺傳穩(wěn)定性及多態(tài)性[27]。O∶3血清型菌株的聚類相似性為79.63%，O∶9血清型菌株聚類相似性為83.25%，說明O∶3血清型菌株的PFGE型別更多樣化。來自于19個(gè)省市自治區(qū)的O∶3血清型菌株，酶切為93種帶型，分布較廣的帶型有5個(gè)，菌株數(shù)目占比79.63%，其中K6GN11C30021、K6GN11-C30012為優(yōu)勢(shì)帶型，分別占比46.35%、22.5%。K6GN11C30021是人感染小腸結(jié)腸炎耶爾森菌株的主要帶型，也是豬和犬的主要帶型。K6GN11C30012帶型宿主分布最廣泛，除了分布于腹瀉病人、家畜家禽及食品中，嚙齒類和兔源株中也有分布且為這兩種宿主的優(yōu)勢(shì)帶型。不同帶型的菌株地域分布范圍具有差異：K6GN11C30021、K6GN11C30012分布最廣泛、均分布于17個(gè)省市自治區(qū)，其次為K6GN11C30042(13個(gè)省)、K6GN11C30068(8個(gè)省)、K6GN11C30058(5個(gè)省)，而K6GN11C30064僅分布于廣西，K6GN11C30051僅分布于江蘇。不同宿主中帶型種類最為多樣的為豬源菌株，其次為人和犬分離菌株。毒力質(zhì)粒的丟失不影響PFGE帶型。

不同地區(qū)人源菌株P(guān)FGE型別分析發(fā)現(xiàn)，共有14個(gè)省份的人源菌株與當(dāng)?shù)貏?dòng)物、食品分離株具有相同的PFGE型別，提示動(dòng)物或食品分離株與人類感染間可能存在關(guān)聯(lián)。O∶3血清型人源菌株分布于14個(gè)省份共有20種帶型，多數(shù)省份人源菌株具有2種以上帶型，在當(dāng)?shù)貏?dòng)物、食品分離株發(fā)現(xiàn)相同帶型。O∶9血清型人源菌株分布于5個(gè)省份共有5種帶型，4個(gè)省份在當(dāng)?shù)貏?dòng)物、食品分離株發(fā)現(xiàn)相同帶型。因此應(yīng)加強(qiáng)動(dòng)物及食品的監(jiān)測(cè)力度，防止人群通過染疫的動(dòng)物及食品感染。

利益沖突：無