胡婷婷，劉 淦，王文靜，李 磊，李夢珠，楊進孫，孫恩濤，陶香林

瘧疾是一種危害性極強的人獸共患性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2017年發(fā)生2.31億例瘧疾病例，造成41.6萬人死亡，2018年發(fā)生2.28億例，造成40.5萬人死亡，2018年疫情與2017年基本持平但情況仍不容樂觀[1]。各國之間頻繁的交流，增加了瘧疾向低風險地區(qū)傳播及藥物抗性蟲株于全球范圍內(nèi)傳播擴散的風險[2]。瘧疾溯源有助于追溯藥物抗性蟲株起源、明確瘧疾發(fā)源地及傳播路徑，及時制定應對措施阻斷其傳播[3]。

單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)組合、微衛(wèi)星標記、單倍型網(wǎng)絡是目前用于瘧疾溯源的常規(guī)分子標記。Daniels等[4]曾選擇SNP作為分子標記進行溯源，但如何高通量獲取這些樣本的SNP仍需要測序技術(shù)及生物信息學分析方法的優(yōu)化。微衛(wèi)星標記的方法相對簡便，但各實驗室標準未完全統(tǒng)一，故在推廣應用上存在限制性[5]。單倍型網(wǎng)絡進行溯源時，因頻繁的重組，使研究核基因組中單核苷酸多態(tài)性單倍型之間的祖先關系變得很復雜。綜上，以上方法均存在一定弊端，故選擇簡便性、特異性的分子標記物用于瘧原蟲的溯源迫在眉睫。

隨著分子生物學研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)不同地域間的瘧原蟲存在表型差異，且越來越多的研究選擇通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹研究瘧疾的地理起源[6-7]。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的分子標記物有mtDNA、SSU rRNA、18S rRNA等，而18S rRNA基因在確定瘧疾病原發(fā)源地時，準確性、特異性相較其他溯源分子標記物更有優(yōu)勢：18S rRNA極為保守，常作為靶基因應用于瘧原蟲基因檢測以及真核生物種屬之間的親緣關系比較。鑒于其進化緩慢，18S rRNA基因通常也適用于古老生物的進化分析。原蟲的18S rRNA 基因在不同蟲種間的變化比原核生物、真菌和動植物間的差異大，可用來確定原蟲之間的親緣關系[8]。18S rRNA基因在瘧原蟲的各個發(fā)育階段都有表達，據(jù)此設計瘧原蟲種間特異引物相對合理，相對于瘧原蟲其他標記基因而言，更適合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[9-14]。Snounor、Stephaine等的相關研究證明瘧原蟲18S rRNA基因是追溯瘧原蟲地理起源可靠的分子標記物[15-16]。本研究構(gòu)建瘧原蟲18S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹，建立基于瘧原蟲18S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析的溯源方法，研究瘧原蟲的地理起源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 瘧原蟲基因序列 收集皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院2018年8月至2019年9月期間4例輸入性瘧疾患者的血樣，收集樣本經(jīng)皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院倫理委員會批準。對血樣采取提取、擴增、測序等一系列操作獲得基因序列，其余地區(qū)基因數(shù)據(jù)從GenBank中搜集整理。

1.1.2 病歷資料 患者一：男，53歲，安徽省蕪湖市人，于 2019年9月從非洲回國，因頭暈頭痛、全身肌肉酸痛等癥狀到蕪湖市弋磯山醫(yī)院就診，確診為瘧疾感染。患者二：男，48歲，安徽省蕪湖市人，長期于非洲工作，回國后因右上腹持續(xù)隱痛到蕪湖市弋磯山醫(yī)院就診，確診為瘧疾感染?；颊呷耗校?3歲，安徽省蕪湖市人，于2019年1月從非洲回國，因發(fā)熱、頭痛等癥狀到蕪湖市弋磯山醫(yī)院就診，確診為瘧疾感染。患者四：男，65歲，安徽省南陵縣人，在非洲尼日利亞居住4月有余，回國后因不慎摔倒出現(xiàn)大小便失禁、意識模糊癥狀到蕪湖市弋磯山醫(yī)院就診，確診為瘧疾感染。

1.1.3 主要試劑和儀器 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根)、磁珠法基因組血液DNA抽提試劑盒(上海生工)、T載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒(上海生工生物有限公司)、小型磁力架(上海生工)、離心機(Eppendorf 5430/R)、EPS-100核酸電泳儀Power Supply(上海天能 Tanon)、PCR擴增儀(Eppendorf)、、通用化學發(fā)光、熒光和可見光成像系統(tǒng) FluorChem FC3(美國 Protein Simple公司)。

1.2 方 法

1.2.1 瘧原蟲基因提取和擴增 磁珠法基因組血液DNA抽提試劑盒(上海生工)瘧原蟲基因組DNA提取、內(nèi)外引物瘧原蟲18S rRNA基因巢式PCR擴增(瘧原蟲屬特異性引物(外)rPLU5、rPLU6、惡性瘧原蟲種特異性引物(內(nèi))rFAL1、rFAL2)。引物序列見表1。巢式PCR擴增反應程序和體系參照朱垚吉等[10]。

表1 瘧疾患者血樣18S rRNA基因擴增引物序列

1.2.2 基因克隆測序分析 純化PCR產(chǎn)物、連接純化產(chǎn)物形成重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導入DH5α感受態(tài)細胞，用含氨芐抗生素的固體培養(yǎng)皿篩選出陽性質(zhì)?？寺。捎秒p脫氧鏈末端終止法(正反向)測序，于NCBI上進行測序結(jié)果BLAST比對分析。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 用于瘧疾溯源的18S rRNA基因參比序列從GenBank獲取，建樹所選的參比序列的地理來源包含亞洲、非洲、北美洲等地區(qū)。參比序列與血樣測序所得序列采用Clustal X、Edit Sequence軟件進行序列分析、編輯及截取。用MEGA X對基因序列進行同源性分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，進化距離選項選擇Maximum Composite Likelihood，根據(jù)基因特征選擇鄰接法(N-J)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap法進行1 000次自舉檢驗。惡性瘧原蟲株來源及核苷酸序列見表2。

表2 惡性瘧原蟲株來源及核苷酸序列

2 結(jié) 果

2.1 血樣標本18S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物 利用合成的引物擴增4份血樣的18S rRNA基因，產(chǎn)物長度均為206 bp，經(jīng)測序和NCBI-BLAST比對，結(jié)果顯示4例患者均是感染惡性瘧原蟲。

2.2 測序標本信息 對4份血樣PCR擴增產(chǎn)物進行測序后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并分析，結(jié)果顯示本研究采集的4份瘧疾患者血樣(序列號：MT991411-MT991414)均為非洲本地感染(見圖1)。

“*”表示本實驗研究的4份血樣所得序列

2.3 基因變異特征 4份惡性瘧血樣18S rRNA基因雙向測序、剪接、拼接得到18S rRNA的靶序列，其余惡性瘧地理株序列從 GenBank 中獲得。用Clustal X(1.81)軟件對這些序列進行排序比較及分析。惡性瘧18S rRNA靶序列長度為206 bp，其中A占比31.4%，G占比16.4%，T占比40.4%，C占比11.8%；A+T占比71.8%，C+G占比28.2%，即堿基以A+T較多見，基因變異以顛換堿基數(shù)較多見，轉(zhuǎn)換與顛換率為0.6，主要發(fā)生在第三堿基位點，見表3。

表3 惡性瘧地理株18S rRNA基因堿基對轉(zhuǎn)換、顛換數(shù)

2.4 基因同源性及遺傳距離 使用MEGA X軟件選擇Maximum Composite Likelihood法計算同源性及遺傳距離，結(jié)果如表4所示：來自非洲的惡性瘧原蟲株與來自亞洲-2的惡性瘧原蟲株同源性較近、遺傳距離較?。环侵夼c亞洲-1、非洲與北美洲的惡性瘧原蟲株同源均性較遠、遺傳距離均較大。

表4 非洲、亞洲、北美洲惡性瘧地理株18S rRNA基因序列的同源性及遺傳距離比較

2.5 18S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹 N-J法基于18S rRNA基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1。23個惡性瘧原蟲株大致分成3大分支：來自亞洲的部分惡性瘧原蟲株(GenBank登錄號為：KT991230、KT991172、KT991186、GU816249)與來自非洲的惡性瘧原蟲株關系密切，形成一大分支；其余亞洲的惡性瘧原蟲株形成一大分支，且分布在進化樹的外支；來自北美洲的惡性瘧原蟲株形成另一分支。

在亞洲的惡性瘧原蟲分離株中我們發(fā)現(xiàn)了2種拓撲類型，將其命名為亞洲-1(Asia1)、亞洲-2(Asia2)。在系統(tǒng)發(fā)育樹中我們發(fā)現(xiàn)，亞洲-2與來自非洲的惡性瘧原蟲株聚為一支，推及其同源性及遺傳距離，可以看出亞洲-2與非洲的同源性近、遺傳距離?。幌喾吹?，亞洲-1與亞洲-2的同源性較遠、遺傳距離大。

3 討 論

瘧疾是瘧原蟲感染導致的傳染病，主要為按蚊叮咬傳播，少數(shù)為輸血傳播，存在高、低風險區(qū)交互傳播風險[15-16]。瘧疾溯源對于追溯瘧疾發(fā)源地或者追溯藥物抗性蟲株起源及傳播路徑的相關技術(shù)研究十分重要。

本研究基于瘧原蟲18S rRNA基因進行PCR擴增，對擴增結(jié)果進行測序分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析瘧原蟲的地理起源，相對于Moritoshi Iwagami等通過構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡分析瘧原蟲的地理起源而言，操作簡單[26-28]。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，所選4例惡性瘧原蟲株與系統(tǒng)發(fā)育樹內(nèi)非洲的瘧原蟲株遺傳關系較近，聚集在同一亞支，查詢患者病歷資料后發(fā)現(xiàn)實際輸入地與發(fā)育樹展示結(jié)果相符。亞洲的惡性瘧原蟲分離株呈現(xiàn)出2種拓撲類型，說明基因變異和遺傳距離可導致同一地區(qū)瘧原蟲株的基因序列呈現(xiàn)出地理聚集差異和不同的空間聚類特征，在系統(tǒng)發(fā)育樹中并不按照地理聚集[29-30]。北美洲的不同瘧原蟲株按照地理來源分別聚集在相同的進化亞支內(nèi)。以上證明，瘧原蟲種群會根據(jù)地理位置分成不同的亞群，且人類活動會影響種群的分配，即根據(jù)該特性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹來判斷瘧疾地理起源具有可行性[31]。以上結(jié)果表明18S rRNA基因是進行瘧疾溯源研究的準確性、特異性的分子標記。未來可通過18S rRNA 的全基因測序進行系統(tǒng)發(fā)育分析，深入研究18S rRNA作為分子標記來判定瘧疾是本地還是外地輸入性的實用性。系統(tǒng)發(fā)育分析能夠快速準確地定位感染的地理來源，是確定輸入性疫情來源的有價值的公共衛(wèi)生工具[32-33]。

利益沖突：無