王妍妍，趙永新，王建強(qiáng)，康麗霞，王 輝

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院檢驗科，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院病理科，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

國際癌癥研究機(jī)構(gòu)2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌已取代肺癌成為全球第一大癌癥，新發(fā)病例高達(dá)226萬例，其中中國新發(fā)乳腺癌為42萬例[1]。乳腺癌早期無特異性癥狀，很多患者確診時已為中晚期，失去了最佳的手術(shù)時機(jī)，預(yù)后不良，因此，乳腺癌的早期診斷極為重要[2]。癌癥的發(fā)生、發(fā)展與原癌基因和抑癌基因的異常激活密切相關(guān)。人類B細(xì)胞淋巴瘤因子3(B-cell lymphoma factor 3,Bcl-3)基因位于19q13染色體，是一種原癌基因，主要參與調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡，其異常表達(dá)最早見于慢性B細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血病[3]。隨著研究的不斷深入，Bcl-3被發(fā)現(xiàn)在多種實體腫瘤組織中過度表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[4-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-3高表達(dá)可以抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡，從而參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[7-8]。血清為臨床容易獲得的標(biāo)本，Bcl-3蛋白在乳腺癌患者血清中的表達(dá)情況目前尚不明確。本研究旨在探討B(tài)cl-3蛋白在乳腺腫塊患者血清和腫塊組織中的表達(dá)情況，以期為乳腺癌的臨床診斷尋求新的、快捷的標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年12月至2019年3月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院收治的56例乳腺腫塊患者為研究對象，患者年齡23～63歲，中位年齡43歲；患者術(shù)前均未接受化學(xué)治療、放射治療，且臨床病理資料完整；所有乳腺腫塊組織行病理學(xué)檢查，根據(jù)病理學(xué)檢查結(jié)果將患者分為非腫瘤組(包括乳腺炎、乳腺導(dǎo)管擴(kuò)張癥、乳腺增生癥、脂膜炎、乳腺腺病)12例、良性腫瘤組(包括乳腺腺病伴導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤、纖維腺瘤、纖維脂肪瘤、乳腺腺病伴纖維腺瘤、乳腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤)24例、惡性腫瘤組(包括乳腺浸潤性小葉癌、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、非特殊型浸潤性癌)20例；非腫瘤組、良性腫瘤組和惡性腫瘤組患者的年齡分別為29～50(40.6±28.09)、24～50(42.14±8.54)、32～60(48.20±7.38)歲，3組患者的年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器Bcl-3酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，Bcl-3抗體購自美國Proteintech公司，抗原修復(fù)緩沖液購自河南賽諾特生物技術(shù)有限公司，兔鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-perosidase,SP)法檢測系統(tǒng)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，蘇木精購自深圳康泰生物制品股份有限公司；酶標(biāo)儀購自安圖生物工程股份有限公司，烤片機(jī)、脫蠟機(jī)購自上海徠卡儀器有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)SP法檢測腫塊組織中Bcl-3蛋白表達(dá)取手術(shù)切除的腫塊組織，40 g·L-1多聚甲醛固定，修塊、洗滌、脫水、透明，浸蠟、包埋、切片，常規(guī)脫蠟水化；浸泡于自來水、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solation,PBS)各3次，每次3 min；100 ℃抗原修復(fù)5 min；滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，25 ℃孵育20 min；PBS沖洗3次，每次3 min；滴加山羊血清封閉液，25 ℃孵育20 min；滴加Bcl-3抗體，以PBS代替一抗作為陰性對照，4 ℃冰箱孵育24 h；PBS沖洗3次，每次1 min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，25 ℃孵育20 min；PBS沖洗3次，每次1 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，自來水返藍(lán)，透明，封片；光學(xué)顯微鏡下觀察。Bcl-3蛋白陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核，呈淡黃色、黃色、棕黃色顆粒。結(jié)果判定：每張切片隨機(jī)選取10個高倍(×400)視野，計算10個視野中陽性細(xì)胞百分率，陽性細(xì)胞百分率≤5%計為0分，5%<陽性細(xì)胞百分率≤25%計為1分，25%<陽性細(xì)胞百分率≤50%計為 2分，50%<陽性細(xì)胞百分率≤75%計為3分，陽性細(xì)胞百分率>75% 計為4分。依據(jù)細(xì)胞核染色強(qiáng)度：無染色計為0分；淡黃色計為1分；黃色計為2分；棕黃色計為3分。以陽性細(xì)胞百分率評分與染色強(qiáng)度評分之和作為最終判定標(biāo)準(zhǔn)：0分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性(++)，6～7分為強(qiáng)陽性(+++)；將陰性(-)和弱陽性(+)定義為陰性，陽性(++)和強(qiáng)陽性(+++)定義為陽性。陽性表達(dá)率=陽性例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 ELISA法檢測血清中Bcl-3蛋白水平手術(shù)前抽取患者晨起空腹肘正中靜脈血3 mL，2 500 r·min-1離心5 min，取上層血清，置于-80 ℃冰箱保存，測定時提前解凍恢復(fù)至室溫。設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔，在已包被板上分別準(zhǔn)確滴加血清標(biāo)本50 μL，空白孔除外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃溫育30 min；洗滌5次，拍干；每孔加入顯色劑A、B各50 μL，37 ℃避光顯色15 min；每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。15 min內(nèi)應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測各孔的吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作縱坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度值為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，根據(jù)曲線方程計算各樣本的Bcl-3蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1 3組患者乳腺腫塊組織中Bcl-3蛋白的表達(dá)結(jié)果見圖1。非腫瘤組、良性腫瘤組、惡性腫瘤組患者乳腺腫塊組織中Bcl-3蛋白陽性表達(dá)率分別為16.67%(2/12)、54.17%(13/24)和85.00%(17/20)；惡性腫瘤組患者乳腺腫塊組織中Bcl-3蛋白陽性表達(dá)率顯著高于良性腫瘤組和非腫瘤組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.781、14.521，P< 0.05)；良性腫瘤組患者乳腺腫塊組織中Bcl-3蛋白陽性表達(dá)率顯著高于非腫瘤組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.629，P<0.05)。

A：非腫瘤組；B：良性腫瘤組；C：惡性腫瘤組。

2.2 3組患者血清中Bcl-3蛋白水平比較非腫瘤組、良性腫瘤組、惡性腫瘤組患者血清中Bcl-3蛋白水平分別為(48.10±23.03)、(34.75±17.93)、(22.50±18.29)μg·L-1；惡性腫瘤組患者血清中Bcl-3蛋白水平顯著低于良性腫瘤組和非腫瘤組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.186、3.367，P<0.05)；良性腫瘤組患者血清中Bcl-3蛋白水平顯著低于非腫瘤組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.865，P<0.05)。

3 討論

乳腺癌是女性臨床常見的惡性腫瘤之一，近年來，其發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢。乳腺癌早期無明顯癥狀，易延誤治療時機(jī)，降低患者的生活質(zhì)量[9]。目前，乳腺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是活體組織檢查，但其創(chuàng)傷性大，不易早期檢測，存在一定的局限性[10]。液體活檢由于無創(chuàng)性和低成本，正逐漸成為乳腺癌新的輔助診斷方法[11]。血液采集具有簡單、方便、非侵入性等優(yōu)點，血液中乳腺癌生物學(xué)標(biāo)志物得到了廣泛的研究。乳腺癌易感基因、DNA甲基化、微RNA和循環(huán)腫瘤細(xì)胞等均可以提高乳腺癌的早期診斷率[12]。Bcl-3屬于原癌基因，在多種實體瘤中發(fā)揮作用，本研究旨在通過檢測Bcl-3蛋白在乳腺腫塊患者的乳腺腫塊組織及血清中的表達(dá)，探討B(tài)cl-3蛋白成為乳腺癌生物學(xué)標(biāo)志物的可能性。

細(xì)胞凋亡與腫瘤形成密切相關(guān)，在異常細(xì)胞發(fā)展為癌細(xì)胞的過程中必須繞過凋亡。因此，抗凋亡是腫瘤細(xì)胞的一個重要特征[13]。Bcl-3通過增強(qiáng)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中Hdm2的轉(zhuǎn)錄來下調(diào)p53活性，從而抑制DNA損傷誘導(dǎo)的凋亡[14]。Bcl-3的抗凋亡功能提示其過表達(dá)可為癌細(xì)胞提供生存優(yōu)勢，從而為Bcl-3的原癌發(fā)生功能提供可信的分子機(jī)制。CHOI等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-3高表達(dá)可使促凋亡基因表達(dá)下調(diào)，乳腺癌細(xì)胞凋亡受到抑制。袁建良等[8]研究顯示，Bcl-3在癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，Bcl-3表達(dá)上調(diào)可能參與了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，惡性腫瘤組患者乳腺腫塊組織中Bcl-3蛋白陽性表達(dá)率顯著高于良性腫瘤組和非腫瘤組，良性腫瘤組患者乳腺腫塊組織中Bcl-3蛋白陽性表達(dá)率顯著高于非腫瘤組，提示Bcl-3蛋白與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。

為了探討B(tài)cl-3蛋白是否在乳腺癌患者血清中異常釋放，本研究采用ELISA法分析了各組患者血清中Bcl-3蛋白水平，結(jié)果顯示，惡性腫瘤組患者血清中Bcl-3蛋白水平顯著低于良性腫瘤組和非腫瘤組，良性腫瘤組患者血清中Bcl-3蛋白水平顯著低于非腫瘤組，提示腫塊組織惡性程度越高，血清中Bcl-3蛋白水平越低，這與Bcl-3蛋白在乳腺腫塊組織中的表達(dá)趨勢相反。CHEN等[15]研究發(fā)現(xiàn)，通過細(xì)胞死亡釋放的炎癥因子可誘導(dǎo)Bcl-3的產(chǎn)生，并通過外泌體顆粒自主釋放到血清中。作者認(rèn)為，非腫瘤組患者的乳腺腫塊多處于炎癥階段，引起大量細(xì)胞壞死，釋放大量炎癥因子，炎癥因子誘導(dǎo)Bcl-3產(chǎn)生，并分泌到血清中，導(dǎo)致非腫瘤組血清中Bcl-3蛋白水平升高；腫瘤組患者一般無明顯的全身性炎癥反應(yīng)，血清中Bcl-3蛋白水平較低；但這一現(xiàn)象仍需大樣本研究證實。

綜上所述，乳腺癌組織中Bcl-3蛋白表達(dá)上調(diào)，乳腺癌患者血清中Bcl-3蛋白水平降低，檢測Bcl-3蛋白可能為乳腺癌的診斷提供參考。